那西肽預混劑組分HPLC檢測方法的建立

韓寧寧，徐嫄，于麗娜，郝利華，趙暉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京，100081)

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那西肽預混劑組分HPLC檢測方法的建立

韓寧寧，徐嫄，于麗娜，郝利華，趙暉*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京，100081)

為了建立那西肽預混劑組分測定的高效液相檢查法，采用十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以0.025%磷酸水溶液-乙腈(50∶50)為流動相，檢測波長為241 nm，并以該色譜條件對來自7個廠家的14批不同規(guī)格的那西肽預混劑進行了測定。綜合結果給出組分的建議限度為：那西肽組分A的峰面積不得少于那西肽組分A與組分B峰面積之和的88.0%。該方法具有專屬性強、耐用性好、操作簡便等優(yōu)點。

那西肽預混劑；組分；高效液相色譜法

那西肽是一種含硫多肽類抗生素，我國于1998年批準其為國家三類新獸藥，被農業(yè)部列為可在飼料中長期添加使用的飼料藥物添加劑，對豬雞有促進生長和提高飼料轉化率的作用[1-2]。那西肽預混劑工藝早期是由那西肽原料藥與玉米淀粉、碳酸鈣等配制而成，其質量標準收載于《獸藥國家標準化學藥品、中藥卷》(第一冊)[3]。隨著技術發(fā)展，國內那西肽預混劑生產廠家的生產工藝均已變更為那西肽發(fā)酵液的菌絲體干燥后與碳酸鈣等配制而成。而目前缺少針對發(fā)酵而得的那西肽預混劑的相關國家質量標準，相應的市場監(jiān)督與質量控制也呈空白狀態(tài)。

經文獻檢索，那西肽中含有一主組分A，同時含有一副組分B[4]?！东F藥國家標準化學藥品、中藥卷》(第一冊)中收載的那西肽預混劑質量標準對組分B并沒有相關的控制規(guī)定[3]。根據獸藥協(xié)會提供的資料，對國內7家那西肽預混劑生產企業(yè)內部控制標準中關于組分的相關規(guī)定進行了匯總，結果發(fā)現(xiàn)其中3家企業(yè)并無相關規(guī)定，剩余4家企業(yè)對組分B的限度規(guī)定從不得大于12%至不得大于15%不等。由此可見，不同企業(yè)對組分B的控制缺乏一致性。因此，根據文獻中那西肽預混劑HPLC含量測定方法[5]，經過方法優(yōu)化與驗證，建立了那西肽預混劑組分的HPLC測定法。

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(HPLC)，配紫外檢測器(UV)和二極管陣列檢測器(PDA)(Waters 2695-2487/996)；XS205分析天平(Mettler Toledo)；色譜柱(COSMOSIL C18，5μm，250 mm×4.6 mm)。色譜純乙腈(Merck公司)；分析純磷酸(國藥集團)；去離子水(Millipore純水機過濾)。那西肽標準品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號K0431212，每1mg相當于928那西肽單位，以那西肽A組分計，含量為88.6%。那西肽預混劑供試品共14批，由7家國內生產廠家提供，具體信息見表1。

表1 那西肽預混劑供試品信息表

2 方法與結果

2.1 色譜條件 用十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.025%磷酸溶液(50∶50)為流動相，檢測波長為241 nm，取標準品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，出峰順序為那西肽組分B、那西肽組分A。理論板數(shù)按那西肽組分A峰計算不低于3000，主成分與相鄰雜質峰的分離度應大于1.5。

2.2 對照品溶液與供試品溶液的制備 取供試品適量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入磷酸鹽緩沖溶液5 mL、二甲基甲酰胺50 mL，超聲處理20 min，每隔5 min強力振搖一次，放至室溫，制成每1 mL約含1000單位(規(guī)格：8%、4%、2%)或125單位(規(guī)格：1%、0.5%、0.25%)的溶液，濾過，精密量取續(xù)濾液適量，加二甲基甲酰胺 4 mL，加磷酸鹽緩沖液-乙醇(85∶15)稀釋至刻度，制成每1 mL約含25單位的溶液。對照品溶液同法配制。供試品溶液應現(xiàn)配先用。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性 采用PDA檢測器，在擬定方法下檢測，獲得標準品溶液和供試品溶液的那西肽組分光譜指數(shù)圖(圖1-圖2)。由圖可見，溶劑峰對組分A與B均無干擾。

圖1 那西肽標準品溶液光譜指數(shù)圖

圖2 供試品溶液光譜指數(shù)圖

2.3.2 檢測限 取0.5單位/ mL的標準品溶液7 μL注入液相色譜儀，組分A的信噪比S/N=3。

以組分A的量(0.5單位/928單位/mg)×(7 μL/1000 μL)×88.6%×1000=0.003 μg作為該方法的檢測限(LOD)。

2.3.3 耐用性 取那西肽標準品溶液，采用不同品牌色譜柱以及在不同柱溫、不同流速、不同pH值下進行測定，對該方法的耐用性進行考察。

2.3.3.1 采用三款不同品牌色譜柱，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，考察方法耐用性，結果三款色譜柱均可滿足方法系統(tǒng)適用性要求，參見表2。

表2 三款不同品牌色譜柱的柱效比較

*1：C18，5μm，4.6 mm×250 mm

*2：C18，5μm，4.6 mm×150 mm

2.3.3.2 用COSMOSIL C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱，流速為1.0 mL/min，分別設定25℃、30℃和35℃的柱溫，考察不同柱溫的影響。結果隨著柱溫升高，組分A與B的保留時間均略有提前，但組分A的理論塔板數(shù)及組分A與B的分離度基本不受影響，參見表3。

表3 不同柱溫的影響結果表

2.3.3.3 用COSMOSIL C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱，柱溫為30℃，分別設定0.8、1.0、1.2 mL/min的流速，考察不同流速的影響。結果見表4。由結果可知，隨著流速升高，組分A與B的保留時間均提前，組分A的理論塔板數(shù)及組分A與B的分離度均略有下降，但均仍符合擬定方法的要求。

表4 不同流速的影響結果表

2.3.3.4 用COSMOSIL C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱，柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min，將流動相中的水相分別設定為0.0125%磷酸溶液、0.025%磷酸溶液、0.05%磷酸溶液，考察不同pH值的影響。結果三種不同濃度磷酸溶液的流動相對組分A的理論塔板數(shù)及組分A與B的分離度基本沒有影響，參見表5。

表5 不同pH值的影響結果表

2.3.4 被測溶液的穩(wěn)定性 取一份每1 mL約含25單位的供試品溶液，在室溫放置0、1、2、4、8、12和24 h進樣，考察供試品穩(wěn)定性，結果見表6。結果顯示，隨著室溫放置時間的延長，組分A與B的峰面積均在逐漸減小，放置24 h后，二者峰面積均減少10%以上。由于每1 mL約含25單位的供試品溶液穩(wěn)定性較差，我們又另取一份每1 mL約含1000單位的供試品溶液，在室溫放置0、1、2、4、8、24和48 h進樣，考察其穩(wěn)定性，結果見表6。結果顯示，隨著室溫放置時間的延長，雖然組分A的峰面積變化不大，二者總面積也變化不大，但是組分B的峰面積逐漸增大(增大了60%左右)。因此，在擬定方法中規(guī)定供試品溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

表6 供試品溶液穩(wěn)定性測定結果表

2.4 供試品測定 采用擬定方法對14批不同規(guī)格那西肽預混劑的組分進行測定。測定結果見表7。

2.5 結果分析 由結果可知，不同生產企業(yè)組分A的差距較大，從98.3%至83.9%不等，根據中國獸藥協(xié)會提供的相關資料可查，企業(yè)內各批次間的組分也有較大差異，但約90%的產品均可符合組分A不小于88.0%這一限度，再結合各企業(yè)的內部控制標準相關規(guī)定，擬將那西肽預混劑組分A的限度規(guī)定為不小于88.0%。

表7 14批那西肽預混劑組分測定結果統(tǒng)計表

3 討論

3.1 溶媒的選擇 文獻方法[5]中，供試品溶液配制第一步溶解與提取過程與效價含量測定方法基本一致，而第二步稀釋過程采用甲醇。將第二步也更改為與效價測定方法一致，即采用二甲基甲酰胺4 mL及磷酸鹽緩沖液-乙醇(85：15)稀釋。這一改變可以使組分測定直接采用效價測定項下每1 mL約含25單位的供試品溶液，簡化實驗操作，節(jié)省試劑消耗。將溶媒更改前與更改后的那西肽標準品色譜進行了比較，發(fā)現(xiàn)除溶劑峰稍有差別外，那西肽組分A的理論塔板數(shù)及A與B的分離度均不受影響。

3.2 色譜柱的選擇 文獻方法中，填充劑類型有苯基鍵合硅膠[4,6]和十八烷基鍵合硅膠[5]2種。將2種色譜柱類型進行了比較，結果發(fā)現(xiàn)那西肽組分A的理論塔板數(shù)及A與B的分離度均可符合要求，因此擬采用實驗室更為通用的十八烷基鍵合硅膠柱進行測定。

3.3 檢測波長的選擇 采用PDA檢測器對那西肽組分A與B進行了全波長掃描，結果發(fā)現(xiàn)二者均在217和333 nm附近有最大吸收。我們嘗試將檢測波長更改為217 nm，結果發(fā)現(xiàn)溶劑峰影響增強，甚至將組分B部分覆蓋。而將檢測波長更改為333 nm，雖然溶劑峰的影響會大大降低，但會使組分A與B的響應均減弱。因此仍采用241 nm作為檢測波長。

3.4 流動相的選擇 嘗試將流動相中的乙腈更換為甲醇，結果發(fā)現(xiàn)在100 min內那西肽組分A與B均未出峰，將甲醇換回乙腈后才可將組分A與B沖出。這表明甲醇對組分A與B保留過強，不適宜作本方法的流動相。而后嘗試將0.025%的磷酸水溶液更換為水，結果發(fā)現(xiàn)會導致組分A與B的分離度顯著降低(其他色譜條件相同的情況下，組分A與B的分離度由5.0降低至2.3)。因此仍采用參考方法[5]中的流動相：乙腈-0.025%磷酸水溶液(50∶50)。

3.5 那西肽組分B與組分A相對保留時間的確定 考察了不同品牌色譜柱及不同流速那西肽組分B相對A的保留時間。結果組分B相對A的保留時間為0.80或0.74。考慮到不同品牌色譜柱對相對保留時間的影響較大，因此采用標準品溶液定位的方法確定組分B相對A的保留時間。

[1] 沈順新，任銀娥. 那西肽對豬生長性能的影響[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2008, 35(11): 151-152．

[2] 孫小青，宋代軍. 那西肽的飼用性質及其應用[J]. 飼料研究，2007(12): 36-38．

[3] 中國獸藥典委員會. 獸藥國家標準化學藥品、中藥卷(第一冊)，那西肽預混劑[S].

[4] 張秀英，陸連壽，溫芳,等. 國家那西肽標準品的研制與建立[J]. 中國獸藥雜志，2014，48(12): 50-53.

[5] 段紅，翟科峰，劉瑞華,等. HPLC測定那西肽預混劑中那西肽的含量[J]. 光譜實驗室，2012， 29(2): 836-839.

[6] 張秀英，陸連壽，溫芳,等. 高效液相色譜法測定那西肽的純度[J]. 中國獸藥雜志，2013，47(7): 22-24.

(編輯：陳希)

The Establishment of The HPLC Method to Determine Component in Nosiheptide Premix

HAN Ning-ning, XU Yuan, YU Li-na, HAO Li-hua, ZHAO Hui*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

The HPLC method of component determination for Nosiheptide premix was established. The operation conditions were performed on C18 column with a mobile phase of 0.025% phosphoric acid solution-acetonitrile (50∶50). The detection wavelength was 241 nm. According to this method, the component of 14 batches of Nosiheptide premix from 7 manufacturers was determined. Based on the results, a proposed limitation of the component was given: the peak area of Nosiheptide component A can not less than 88.0% of the total peak area of component A and B.This method has special property, good durability and simple operation.

Nosiheptide premix; component; HPLC method

韓寧寧，碩士，從事抗生素檢驗及檢測方面工作。

趙暉。E-Mail:171977364@qq.com

2015-08-19

A

1002-1280 (2015) 10-0027-05

S859.796