益生菌對腸黏膜屏障的保護及作用機制研究進展

伊淑帥，王開，胡桂學(xué)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

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益生菌對腸黏膜屏障的保護及作用機制研究進展

伊淑帥，王開，胡桂學(xué)*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

益生菌可以通過調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達，增加黏液分泌，抑制腸上皮細(xì)胞異常凋亡，激發(fā)腸黏膜免疫應(yīng)答，從而保護腸黏膜屏障。對腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)、病原菌對腸黏膜的損傷以及益生菌在受損腸黏膜保護及修復(fù)中的作用機制進行了綜述，旨在闡明益生菌對維護機體健康的重要意義。

益生菌；腸黏膜屏障；保護；作用機制

腸道黏膜是動物機體內(nèi)環(huán)境與腸腔內(nèi)物質(zhì)最大的接觸表面，不僅具有吸收營養(yǎng)物質(zhì)的功能，還具有防止腸道內(nèi)病原菌與食物性抗原入侵機體的屏障功能。腸黏膜屏障作為機體防御病原菌感染、預(yù)防炎癥發(fā)生的重要組成成分，對維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)意義重大。近年來，由病原菌感染、腹腔疾病、炎癥性腸病、急性胰腺炎等多種病因引起的腸黏膜損傷引起了人們的關(guān)注，如何保護腸黏膜屏障并修復(fù)受損黏膜屏障成為亟需解決的問題[1-2]。益生菌是一類對宿主機體有益的活微生物的總稱，能夠改善和預(yù)防疾病，目前已經(jīng)證明益生菌可以用于治療抗生素相關(guān)性腹瀉、炎癥性腸病與腸易激綜合征等腸道疾病[3]。益生菌可以通過維護腸黏膜屏障的完整性、降低腸黏膜通透性等多種途徑抑制病原菌在腸黏膜表面的易位，以阻止毒素和有害物質(zhì)進入血液循環(huán)，防止病原菌進一步入侵機體，預(yù)防疫病發(fā)生[4]。

1 腸黏膜屏障

腸黏膜屏障主要由機械屏障、免疫屏障、微生物屏障與化學(xué)屏障組成，可以有效阻止腸道內(nèi)共生菌、大分子抗原物質(zhì)、毒素等進入腸組織細(xì)胞以及血液循環(huán)系統(tǒng)，保護機體健康。

1.1 機械屏障 腸黏膜機械屏障由黏液層、腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells, IECs)與細(xì)胞間的緊密連接(tight junction, TJ)組成，是決定腸黏膜通透性的關(guān)鍵因子。黏液由杯狀細(xì)胞分泌，主要組成成分是黏液蛋白(mucus protein, Muc)，是阻礙共生菌與食物性抗原入侵機體的物理屏障，也是機體的天然抗炎屏障。病原菌入侵時，Muc可以向樹突狀細(xì)胞傳遞抗原信號，激發(fā)黏膜免疫應(yīng)答[5]。IECs主要由柱狀細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞及未分化細(xì)胞組成，構(gòu)成了機體抵御病原微生物的一道重要防線。TJ是位于IECs頂端側(cè)面的多蛋白復(fù)合體，主要包括occludin蛋白、claudin蛋白、ZO蛋白與連接黏附分子(junctional adhesion molecule, JAM)等多種結(jié)構(gòu)蛋白及各類連接蛋白分子，在維持腸黏膜上皮細(xì)胞屏障功能、調(diào)節(jié)腸黏膜通透性以及維持細(xì)胞骨架完整性上起著重要的作用[6]。

1.2 免疫屏障 腸黏膜免疫屏障主要由腸道相關(guān)淋巴組織(gut associated lymphoid tissue, GALT)、免疫細(xì)胞與相關(guān)免疫分子組成，是機體攝取、處理與遞呈抗原信號，發(fā)生免疫應(yīng)答的重要場所。GALT主要包括派伊氏結(jié)(peyer’s patch, PP)、腸系膜淋巴組織(mesenteric lymph nodes, MLN)、腸道固有層與腸上皮淋巴組織[7]。免疫細(xì)胞主要由抗原遞呈細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞組成，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)、PP結(jié)內(nèi)的微皺褶細(xì)胞(microfold cell, M細(xì)胞)、肥大細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞與T細(xì)胞(主要是CD4+T細(xì)胞)、B細(xì)胞、漿細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞。相關(guān)免疫分子是腸黏膜發(fā)揮免疫屏障作用、介導(dǎo)免疫應(yīng)答的主要物質(zhì)，包括分泌型免疫球蛋白A(secreted Immunoglobulin A, sIgA)、防御素(defensin, DEF)、腸三葉因子(intestinal trefoilfactor, ITF/TFF3)以及多種細(xì)胞因子[8]。

1.3 微生物屏障 腸道是機體內(nèi)最大且最復(fù)雜的微生物區(qū)系，腸道菌群包括大約50個不同屬內(nèi)的500多種不同種的細(xì)菌。健康動物體內(nèi)，有益菌與有害菌并存，兩者相互協(xié)調(diào)與相互制約，從而維系著腸道菌群平衡。腸道內(nèi)的微生物在腸黏膜表面形成了多層次的微生物膜，構(gòu)成了腸黏膜微生物屏障。雙歧桿菌與乳酸桿菌是構(gòu)成微生物屏障的主要菌群，可以使腸道處于無氧狀態(tài)，抑制需氧菌的定植[9]。

1.4 化學(xué)屏障 消化道分泌的胃酸、膽汁、各類消化酶與溶菌酶等構(gòu)成了腸黏膜化學(xué)屏障。這些化學(xué)物質(zhì)可以抑制病原菌在腸黏膜的增殖，甚至殺滅病原菌以調(diào)節(jié)胃腸環(huán)境，從而防止病原菌對腸黏膜造成損傷[9]。

2 病原菌對腸黏膜屏障的損傷

健康的人和動物腸道內(nèi)各種細(xì)菌共生，形成了一個動態(tài)平衡的微生物區(qū)系，只有當(dāng)大量外源致病菌入侵機體或腸道內(nèi)微生物菌群被破壞時才會引起腸道感染性疾病的發(fā)生。病原菌入侵腸道后，可以通過誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞異常凋亡、增加腸上皮細(xì)胞間的通透性以加速病原菌、毒素和食物性抗原的易位，引發(fā)內(nèi)源性感染。此外，病原菌還可以通過激活肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase, MLCK)調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的分泌，開放腸上皮細(xì)胞間隙，引起腸黏膜屏障損傷[10]。病原菌感染后，被IECs表面的模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)識別，激活細(xì)胞內(nèi)MyD88/NF-κB/P38等信號級聯(lián)反應(yīng)，抑制緊密連接蛋白occludin、claudin與ZO的表達分泌，增加上皮細(xì)胞通透性[11]。腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhageEscherichiacoli, EHEC)O157H7感染T84細(xì)胞模型研究證明，大腸桿菌通過抑制依賴蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的信號通路，抑制ZO蛋白分泌，增加細(xì)胞間通透性[12]。體內(nèi)感染EHEC可以引起occludins、claudin-3與claudin-2的表達抑制，導(dǎo)致細(xì)胞間TJ中斷，破壞細(xì)胞骨架，造成腸黏膜屏障損傷[13]。

病原菌引發(fā)腸黏膜屏障損傷的另一個重要途徑是通過細(xì)胞信號級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)腸黏膜免疫應(yīng)答，引發(fā)腸道炎癥。病原菌主要通過濾泡相關(guān)上皮細(xì)胞，特別是M細(xì)胞進行細(xì)菌易位，觸發(fā)細(xì)胞死亡，引發(fā)炎癥[10]。感染初期，病原菌粘附到M細(xì)胞表面(主要是胞外寄生菌，如大腸桿菌)或進入巨噬細(xì)胞和DC內(nèi)(主要是胞內(nèi)寄生菌，如沙門菌)進行增殖，通過抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl及caspase的表達抑制細(xì)胞的正常凋亡，從而逃避腸道免疫細(xì)胞的監(jiān)視，逃避免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)[14-15]。感染后期，病原菌大量增殖，成為腸道優(yōu)勢菌群，開始誘導(dǎo)IECs的異常凋亡以利于進入深層組織，造成全身感染[14]。病原菌通過引發(fā)腸道炎癥誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌大量的炎性因子，產(chǎn)生的炎性因子如IL-1β、TNF-α、IFN-γ與NO等均可以激活MLCK，增加細(xì)胞間通透性[16]。細(xì)胞間通透性增加，導(dǎo)致腸道內(nèi)的內(nèi)毒素、外毒素以及有害物質(zhì)進入深層組織細(xì)胞及血液循環(huán)系統(tǒng)，引發(fā)全身炎癥綜合征，嚴(yán)重者可導(dǎo)致多器官衰竭，造成全身性感染。腸黏膜損傷還可以引起膿毒癥、腹腔疾病、腸易激綜合征、食物過敏與炎癥性腸病等，嚴(yán)重影響機體健康。

3 益生菌對受損腸黏膜的保護及修復(fù)

鑒于腸黏膜屏障對動物機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定與機體腸道健康的重要性，尋找并研究對腸黏膜屏障具有保護作用或?qū)κ軗p腸黏膜具有修復(fù)作用的物質(zhì)意義重大。目前，已發(fā)現(xiàn)多種物質(zhì)具有保護腸黏膜屏障的功能，如益生菌，甘氨酸，微量元素Zn、Se，維生素A以及姜黃素等。益生菌作為一種安全可靠的活菌制劑，可以維持腸道菌群平衡、增強腸黏膜屏障、提高機體免疫力，關(guān)于益生菌對受損腸黏膜的保護及修復(fù)也已有大量研究。

3.1 體外研究 目前，體外多采用建立的單層細(xì)胞模型模擬腸黏膜屏障進行相關(guān)研究，主要包括Caco-2細(xì)胞、HT-29細(xì)胞、T84細(xì)胞、IECs與豬小腸上皮細(xì)胞IPEC等。體外研究證明，益生菌可以提高單層細(xì)胞跨膜電阻(transepithelial resistance, TER)，誘導(dǎo)TJ蛋白occludin、claudin、ZO與JAM的分泌以降低細(xì)胞間通透性，保護腸黏膜屏障。益生菌細(xì)胞壁中的大分子物質(zhì)如脂磷壁酸被PRRs識別后引起相關(guān)信號通路的激活，抵抗病原菌對腸黏膜屏障的損傷[9,17,18]。益生菌VSL#3可以通過促進TJ蛋白occludin與claudin-1的表達，修復(fù)TNF-α引起的HT-29單層細(xì)胞損傷，保護上皮細(xì)胞屏障[19]。腸侵襲性大腸桿菌(EnteroinvasiveEscherichiacoli, EIEC)可以粘附到腸上皮細(xì)胞表面，通過抑制TJ蛋白的分泌增加細(xì)胞間通透性，造成腸黏膜屏障損傷。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌、雙歧桿菌與植物乳桿菌等均可以通過促進TJ蛋白occludin、claudin-1、JAM與ZO-1的分泌，并對TJ蛋白進行重新分配以降低細(xì)胞間通透性，減緩EIEC引起的細(xì)胞通透性增加[20-21]。益生菌還可以通過抑制多種細(xì)胞因子如IL-6、IFN-γ、NO等的信號傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)TJ蛋白的表達，降低腸黏膜通透性，阻止病原菌對腸黏膜屏障的損傷。Yang等[22]使用羅伊氏乳桿菌I5007作用LPS刺激的IPEC-J2細(xì)胞損傷模型，結(jié)果表明羅伊氏乳桿菌可以增加TER，通過抑制IL-6與TNF-α的表達增加TJ蛋白claudin-1、ZO-1的表達，抑制LPS引起的上皮細(xì)胞損傷。

3.2 動物體內(nèi)研究 近年來，關(guān)于益生菌保護腸黏膜屏障的研究在鼠、豬、雞以及兔等動物體內(nèi)也已有相關(guān)報道。研究的益生菌菌株主要包括鼠李糖乳桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌與布拉氏酵母菌等。大量臨床研究證明，益生菌對病原菌感染、急性胰腺炎、炎癥性腸病與肝移植等多種原因引起的腸黏膜屏障損傷均具有保護與修復(fù)作用。通過表1數(shù)據(jù)可以看出益生菌在動物腸道內(nèi)主要通過促進腸上皮細(xì)胞TJ蛋白的表達降低細(xì)胞間通透性，并通過刺激IECs分泌Muc阻止病原菌對腸上皮細(xì)胞的粘附以及病原菌、毒素在腸道內(nèi)的易位，保護腸黏膜屏障。益生菌還可以通過介導(dǎo)腸黏膜免疫應(yīng)答，刺激B細(xì)胞和T細(xì)胞分化，分泌IgG、IgM與sIgA等，優(yōu)化腸黏膜免疫系統(tǒng)，抑制炎癥對腸黏膜的進一步損傷。

表1 益生菌保護腸黏膜屏障的部分動物實驗研究結(jié)果

4 益生菌保護腸黏膜屏障作用機制

4.1 維持腸道菌群平衡，保護微生物屏障 機體腸道內(nèi)的益生菌構(gòu)成了保護腸黏膜的微生物屏障以阻止有害病原菌對上皮細(xì)胞的損傷。當(dāng)大量外源性病原菌入侵或機體腸道菌群失衡時，會通過破壞微生物屏障引起病原菌的易位，甚至造成對腸黏膜的損傷。補充益生菌可以維持腸道菌群平衡，保護腸黏膜微生物屏障。益生菌主要通過與病原菌競爭粘附位點，分泌有機酸、細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)抑制病原菌增殖，阻止病原菌入侵。益生菌還可以通過消耗腸道內(nèi)氧氣建立無氧環(huán)境調(diào)節(jié)腸道有益菌與有害菌的數(shù)量，以維持腸道微生物菌群平衡。

4.2 促進黏液分泌 腸道黏液層主要由杯狀細(xì)胞分泌的Muc與TFF組成，是隔離機體與腸道病原菌、食物性抗原的第一道屏障。益生菌可以誘導(dǎo)IECs分泌大量Muc以阻止腸黏膜與病原菌接觸，抑制病原菌對IECs的粘附，從而抑制病原菌在腸壁的定植[5]。Muc還可以與病原菌特異性結(jié)合，加快腸道蠕動，使病原菌排出體外。研究證明，嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌與嬰兒雙歧桿菌等多種益生菌均可以誘導(dǎo)IECs分泌Muc-1、Muc-2以及Muc-3，保護腸黏膜屏障。益生菌還可以誘導(dǎo)IECs分泌TFF，加速損傷腸黏膜的修復(fù)。TFF可以通過促進上皮細(xì)胞的移動加速損傷修復(fù)，保持腸黏膜完整性，還可以與Muc結(jié)合形成凝膠，增強腸黏膜的防御功能[29]。

4.3 促進緊密連接蛋白表達，加固腸黏膜機械屏障 TJ是連接細(xì)胞縫隙，調(diào)節(jié)腸黏膜通透性的關(guān)鍵蛋白，可以阻止腸道中的病原菌、毒素與抗原物質(zhì)通過滲透進入深層腸組織與血液循環(huán)，維持機體健康。益生菌可以激活細(xì)胞內(nèi)PKC信號通路，誘導(dǎo)ZO-1的表達，促進TJ蛋白occludin、claudin磷酸化，通過增強細(xì)胞間緊密連接的組裝過程降低細(xì)胞通透性，達到保護腸黏膜屏障的目的。腸黏膜屏障損傷的另一個重要原因是由于IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、NO以及血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)等炎癥因子的產(chǎn)生，破壞了上皮細(xì)胞屏障功能，使腸黏膜通透性增加。益生菌可以通過促進抗炎細(xì)胞因子IL-10、TGF-β、IL-4等的分泌，抑制炎癥介質(zhì)的分泌以阻止病原菌、促炎因子、內(nèi)毒素等物質(zhì)對TJ的破壞，抑制細(xì)胞因子信號通路介導(dǎo)的腸黏膜損傷，恢復(fù)腸黏膜屏障的完整性[30]。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)益生菌還可以通過上調(diào)熱休克蛋白Hsp72、Hsp25的表達發(fā)揮對TJ蛋白的保護作用，并通過活化PIk3/Akt信號通路增強上皮細(xì)胞屏障[31]。

4.4 激發(fā)腸黏膜免疫應(yīng)答 益生菌進入腸道后，細(xì)胞壁中的大分子物質(zhì)如脂磷壁酸被IECs表面的PRR特異性識別，誘導(dǎo)MAPK、PKC與JAK等信號通路的激活，激發(fā)腸道黏膜免疫應(yīng)答，介導(dǎo)促炎和抗炎細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌，抑制炎癥發(fā)生。益生菌可以促進機體免疫器官發(fā)育，活化IECs中的巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞等，通過促進巨噬細(xì)胞分泌IL-10、TGF-β等抗炎細(xì)胞因子、促進T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞的分化成熟、調(diào)節(jié)Th1/Th2、Th17/Tregs平衡以及增加腸液中IgG、IgM與IgA的含量等多種途徑提高腸道免疫力與抗病力以抵抗感染、炎癥等疾病[32-33]。益生菌還可以誘導(dǎo)IECs分泌sIgA，抑制病原菌對腸黏膜的粘附，防止病原菌與毒素在IECs表面的易位，從而阻止病原菌侵入深層組織，保護機體健康[34]。

4.5 抑制腸上皮細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是機體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，去除異常細(xì)胞而發(fā)生的一種有序的細(xì)胞死亡，是機體正常的生理現(xiàn)象。當(dāng)大量病原菌在機體腸道內(nèi)增殖時，會引發(fā)IECs的異常凋亡以促進病原菌破壞腸黏膜屏障，進入深層腸組織。益生菌可以通過抑制病原菌引起的IECs凋亡，保護腸黏膜屏障，其作用機理主要包括以下三方面：(1)病原菌感染后刺激機體產(chǎn)生TNF-α、IFN-γ與PAF等炎癥因子，導(dǎo)致IECs凋亡增加，益生菌可以通過抑制這些炎癥因子的產(chǎn)生，阻斷細(xì)胞凋亡[35,36]；(2)益生菌可以通過活化Akt/PKB信號通路，抑制P38/MAPK的表達，調(diào)控凋亡基因如Bcl-2等的表達，抑制或阻斷細(xì)胞凋亡[37]；(3)益生菌還可以通過調(diào)控凋亡基因和凋亡抑制基因如死亡受體、caspase及Bcl等的表達，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)合成，從而阻斷凋亡的發(fā)生[38]。

5 展望

長期以來，益生菌作為一種替代傳統(tǒng)抗菌藥物的活菌制劑，廣泛用于維持腸道穩(wěn)態(tài)以預(yù)防疾病發(fā)生，然而益生菌在實際應(yīng)用中仍存在很大的爭議[39]。臨床試驗證明，益生菌可以誘導(dǎo)腸黏膜分泌黏液、抗菌肽與sIgA等抗菌物質(zhì)，保護IECs緊密連接的完整性，降低腸黏膜通透性，增強腸黏膜屏障，維護機體健康。但是，不同機體間存在個體差異，不同的腸道環(huán)境與生理狀態(tài)對益生菌的作用均存在影響。相同個體內(nèi)，菌株的種類、混合菌株或單一菌株、菌株的劑量及菌株的安全性都可以影響菌株在腸道內(nèi)的作用方式[40]。因此，深入研究益生菌在腸道內(nèi)的作用機制以及研發(fā)安全高效的益生菌制劑，對促進動物機體健康發(fā)展具有積極作用。

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(編輯：陳希)

Progress in Protective Effects and Mechanism of Probiotics on Barrier of Intestinal Mucosa

YI Shu-shuai , WANG Kai, HU Gui-xue*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

Intestinal mucosal damage, an important reason for aggravating infection of pathogenic bacteria and destroying homeostasis. How to protect and repair damaged intestinal mucosa has gradually attracted people’s attention. As the research continues, it was found that probiotics can protect the intestinal mucosa barrier through promoting the expression of tight junction proteins, increasing the secretion of mucos, inhibiting the abnormal apoptosis of intestinal epithelial cells, stimulating intestinal mucosal immune responses. In this paper, the significance of probiotics to maintain the health would be provided by expounding the structure of intestinal mucosal barrier, the damage of pathogenic bacteria to intestinal mucosa, the mechanism in the protection and repair of damaged intestinal mucosa.

probiotics; intestinal mucosal barrier; protection; mechanism

國家自然科學(xué)基金項目(31372413)

伊淑帥，碩士研究生，從事益生菌作用機制方面研究。

胡桂學(xué)。E-mail：1217203930@qq.com

2015-07-17

A

1002-1280 (2015) 10-0056-06

R57