樹突狀細胞甘露糖受體在旋毛蟲感染中的變化研究

劉博宇，王丞，邢鑫，陳宏亮，姜晶，蔡亞南，趙權(quán)，王春鳳，楊桂連

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心，長春130118)

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樹突狀細胞甘露糖受體在旋毛蟲感染中的變化研究

劉博宇，王丞，邢鑫，陳宏亮，姜晶，蔡亞南，趙權(quán)，王春鳳，楊桂連*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心，長春130118)

應(yīng)用流式細胞術(shù)(FCM)檢測旋毛蟲感染后小鼠腸系膜淋巴結(jié)(MLN)中樹突狀細胞(DC)上甘露糖受體(MR)的影響。培養(yǎng)小鼠骨髓源樹突狀細胞(BMDC)并負載旋毛蟲排泄/分泌抗原(ES抗原)，F(xiàn)CM檢測BMDC上MR的變化情況。結(jié)果顯示，感染第7天MLN中DC表面MR出現(xiàn)下調(diào)，但在14 d后出現(xiàn)上調(diào)，差異顯著(P<0.05)。體外實驗發(fā)現(xiàn)，BMDC負載ES抗原后MR出現(xiàn)下調(diào)，直到第48小時出現(xiàn)上調(diào)，差異顯著(P<0.05)。本研究證明旋毛蟲感染后可以引起樹突狀細胞上MR的變化，表明MR可能是ES抗原的識別受體。這為研制旋毛蟲樹突狀細胞疫苗提供了支持，并對寄生蟲免疫逃避機制的研究提供了思路。

甘露糖受體；旋毛蟲；樹突狀細胞

旋毛蟲病歷史悠久，多年來一直無法徹底消除。作為一種有著重要研究價值的人獸共患寄生蟲病，旋毛蟲在機體的免疫逃避一直是眾多研究者關(guān)注的焦點。ES抗原是旋毛蟲在宿主體內(nèi)寄生時分泌的復(fù)合抗原，已被證實在宿主對旋毛蟲的免疫反應(yīng)中起著重要的作用[1-2]。ES抗原多以糖蛋白的形式存在，含有大量的甘露糖、巖藻糖等糖類結(jié)構(gòu),這使其可能可以被C型凝集素受體識別[3]。DC既是最強的專職抗原遞呈細胞，又是連接固有免疫與適應(yīng)性免疫的重要橋梁。MR是DC上的C型凝集素受體，可以識別甘露糖結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)MR配體可刺激或抑制多種細胞因子的分泌[4-5]?？乖淖R別與遞呈是適應(yīng)性免疫啟動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，DC對抗原的攝取更是其引發(fā)免疫反應(yīng)的第一步。MR作為模式識別受體，在抗原的攝取上有著關(guān)鍵的作用。本研究利用流式細胞術(shù)，檢測旋毛蟲感染小鼠后不同時間點腸系膜淋巴結(jié)中樹突狀細胞上MR的變化情況，并檢測體外培養(yǎng)的小鼠骨髓源樹突狀細胞與旋毛蟲ES抗原刺激后不同時間點的受體表達的變化情況，以初步探討是否樹突狀細胞上的MR受體在旋毛蟲感染過程中的起到作用，以便為旋毛蟲免疫逃避機制的研究及樹突狀細胞疫苗的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲種和實驗動物 旋毛蟲由本實驗室保種。4～6周齡SPF級雌性BABL/C小鼠60只、4～6周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠10只,均購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要試劑 小鼠FC BLOCK封閉抗體購自美國eBioscience公司；PE標(biāo)記的抗小鼠MR單克隆抗體購自美國Biolegend公司；FITC標(biāo)記的抗小鼠CD11c單克隆抗體購自美國BD公司；小鼠白介素-4(IL-4)和小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF),均購自美國Peprotech公司；FACS緩沖液購自美國BD公司。

1.1.3 主要儀器 BD FACSCanto II流式細胞儀購自美國BD公司；恒溫搖床購自施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 旋毛蟲肌幼蟲的收集 將實驗室保種的小鼠處死，剪碎肌肉組織后用人工消化液(含1%胃蛋白酶和1%濃鹽酸)在37 ℃搖床內(nèi)消化4 h，60目篩網(wǎng)過濾去渣。用37 ℃預(yù)熱的生理鹽水?dāng)?shù)次清洗蟲體后計數(shù)，獲取旋毛蟲肌幼蟲。

1.2.2 旋毛蟲肌幼蟲ES抗原的制備 收集的幼蟲經(jīng)培養(yǎng)，過濾，透析，濃縮后用0.22 μm細菌過濾器過濾即得純凈的旋毛蟲肌幼蟲ES抗原。SDS-PAGE鑒定。

1.2.3 旋毛蟲感染后小鼠腸系膜淋巴結(jié)中DC上MR受體變化研究 36只雌性balb/c小鼠隨機分為2組，每組18只，實驗組每只灌服旋毛蟲肌幼蟲200條。空白組不作處理。兩組小鼠分別于灌胃后第7、14、21、28、35、42天時取脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，每次每組取3只。取腸系膜淋巴結(jié)制備單細胞懸液，計數(shù)。調(diào)整細胞至1×106個每管，制備未加抗體的陰性管和兩個單標(biāo)管。樣品管加入FC BLOCK抗體，孵育15 min以避免熒光抗體的非特異性結(jié)合。加入FITC-CD11c、PE-MR抗體4 ℃孵育1 h，F(xiàn)ACS緩沖液清洗兩次以洗去未結(jié)合的抗體，送檢。

1.2.4 小鼠骨髓源樹突狀細胞的培養(yǎng)及純度測定 改良Talmor等[6]的方法制備BMDC。即脫頸處死雄性C57BL/6小鼠后浸入75%酒精中消毒片刻，無菌沖出骨髓。調(diào)整細胞濃度至1×106/mL，10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后去除未貼壁細胞，加入DC完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清+40 ng/mL白介素4+40 ng/mL GM-CSF+100 IU/mL青鏈霉素+3.9 mg/L β巰基乙醇)，隔天半量換液，至第7天輕輕吹打后收集所有懸浮細胞既為BMDC。BMDC計數(shù)后取部分細胞加入FC BLOCK，孵育15 min后加入FITC-CD11c抗體4 ℃孵育1 h，F(xiàn)ACS緩沖液清洗兩次以洗去未結(jié)合的抗體，送檢純度。

1.2.5 ES抗原體外刺激BMDC后MR的表達量變化 將培養(yǎng)的BMDC分至48孔板中，每孔2×105個細胞，加入200 μL DC完全培養(yǎng)基，實驗共分6組，其中一組空白組，其他分為6、12、24、36、48 h組。分別按照上述五個時間點加入ES抗原，每孔100 μg/mL。加入抗體同1.2.2項，送檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 旋毛蟲肌幼蟲ES抗原的制備及小鼠骨髓源樹突細胞的培養(yǎng) 將獲取的ES抗原進行SDS-PAGE鑒定，鑒定結(jié)果得到約為43、45和49 kDa的條帶(圖1)，符合旋毛蟲ES抗原的特征。應(yīng)用流式細胞術(shù)對培養(yǎng)出的BMDC進行純度檢驗。結(jié)果顯示其純度可以達到實驗的需求(圖2)。

圖1 SDS-PAGE分析ES抗原

圖2 流式細胞術(shù)檢測BMDC

2.2 旋毛蟲感染后小鼠腸系膜淋巴結(jié)中樹突狀細胞表面MR表達量 結(jié)果顯示在腸系膜淋巴結(jié)中，第7天MR的表達下調(diào)，隨后開始上調(diào)，但第28天表現(xiàn)出和對照組接近相同的情況。在第35天又觀察到MR的上調(diào)，第42天與對照組相比基本持平(圖3)。

圖3 MLN中MR的影響(*表示差異顯著P<0.05)

2.3 ES抗原體外刺激BMDC后MR表達量變化 流式結(jié)果顯示，與對照組相比，MR在第6～36 h出現(xiàn)了下調(diào)，差異顯著(P<0.05)，48h出現(xiàn)了升高，差異顯著(P<0.05)(圖4)。

圖4 負載ES抗原的BMDC上MR的變化

3 討論與小結(jié)

寄生蟲的免疫逃避一直以來都是研究的熱點，越來越多的C型凝集素受體被證實在寄生蟲的感染及免疫逃避中起到了一定作用?？乖淖R別與遞呈在免疫逃避中極為關(guān)鍵，黃海斌等研究發(fā)現(xiàn)球蟲感染可以在后期引發(fā)淋巴細胞的變化，推測可能由于缺乏抗原的持續(xù)刺激所導(dǎo)致，而淋巴細胞的活化需要抗原遞呈等過程作為前提[7]。MR作為發(fā)現(xiàn)較早的C型凝集素受體，具有抗原識別的功能，在一些研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了其作用[8]。如克氏錐蟲利用巨噬細胞上的MR逃避固有免疫，使其可以長期寄生[9]。由于MR的胞質(zhì)尾部缺少信號轉(zhuǎn)導(dǎo)序列，故其多與其他受體聯(lián)合引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Aranzamendi等的研究證明ES抗原可以在體外條件下通過TLR4激活MYD88信號通路來壓制DC成熟，但ES抗原作為一種復(fù)合抗原，很可能并非只通過一種受體識別[10]。血吸蟲的研究發(fā)現(xiàn)血吸蟲可溶性蟲卵抗原可以利用MR下調(diào)炎癥反應(yīng)，這提示旋毛蟲的Th2型偏轉(zhuǎn)可能也利用MR[11]。在神經(jīng)囊尾蚴病的研究中發(fā)現(xiàn)敲除MR基因的小鼠的生存率更高，這表明囊尾蚴可能利用MR亂來損傷宿主[12]?；贛R在其他寄生蟲領(lǐng)域的研究，

在本研究中，體外應(yīng)用ES抗原刺激BMDC，我們發(fā)現(xiàn)在感染初期，DC上的MR呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于DC利用MR介導(dǎo)吞噬ES抗原所導(dǎo)致。中后期DC上的MR逐漸上升，推測此時DC已逐漸成熟，抗原攝取能力逐漸降低，抗原遞呈能力逐漸增強。在體內(nèi)實驗中我們發(fā)現(xiàn)感染第7-21天MR的表達均出現(xiàn)上調(diào)，這可能與旋毛蟲的寄生部位主要在腸道有關(guān)。這表明MR在旋毛蟲ES抗原混合對宿主的刺激中發(fā)揮了作用。第28天MR沒有變化，但在35天卻有上調(diào)，由于旋毛蟲在21天后基本進入長期寄生狀態(tài)，這可能是由于感染未成功或組內(nèi)差異較大造成的。結(jié)合體內(nèi)及體外實驗，MR在旋毛蟲感染過程中在MLN出現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢，推測可能DC利用MR識別ES抗原的甘露糖結(jié)構(gòu)，這將有助于DC對ES抗原的識別?？赡苡捎诟腥境跗贒C利用MR來識別ES抗原，導(dǎo)致受體下調(diào)后激活了機體免疫，上調(diào)了MR以便更好的識別抗原。但也不排除ES抗原利用MR抑制DC成熟。旋毛蟲慢性感染可引起Th2型免疫反應(yīng)，但其引發(fā)這種反應(yīng)的具體機制還不清楚。MR作為模式識別受體，可以激活多種細胞因子的分泌變化，在抗原的識別和遞呈中有著重要的作用。DU等的研究證明ES抗原可以利用MR通過Myd88途徑激活細胞因子以減輕膿毒敗血癥的損害[13]。本研究發(fā)現(xiàn)在旋毛蟲感染過程中，DC上 的MR參與了機體對旋毛蟲的免疫反應(yīng)。推測DC對ES抗原的吞噬作用可能依賴于MR的介導(dǎo)，但MR在旋毛蟲感染中起到的具體作用還不清楚，有待于進一步研究。寄生蟲病對畜牧業(yè)危害甚大，研制出有效的新型疫苗至關(guān)重要，但寄生蟲病的疫苗研究卻相對滯后。抗原的攝取與遞呈是機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵，本研究可為旋毛蟲病新型疫苗的研究提供一定的基礎(chǔ)支持。

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(編輯：侯向輝)

Effect ofTrichinellaspiralisInfection on Mannose Receptor of Dendritic Cell on Mice

LIU Bo-yu， WANG Cheng，XING Xin，CHEN Hong-liang， JIANG Jing， CAI Ya-nan， ZHAO Quan，WANG Chun-feng, YANG Gui-lian*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，JilinAgriculturalUniversity；JilinProvincialEngineeringResearchCenterofAnimalProbiotics，Changchun130118，China)

To investigate the effect ofTrichinellaspiralisinfection on MR of dendritic cell(DC)in mesenteric lymph nodes(MLN)on mouse and with cultivation of mouse bone marrow-derived dendritic cells (BMDC) and pulsed ofTrichinellaspiralisexcretory / secretory (ES) antigens, The change of MR on BMDC was detected by FCM. The results showed that the MR receptor on the dendritic cells of MLN was down regulated in seventh days, but it was up-regulated in 14 days. The difference was significant (P<0.05).In virto experiments showed that MR was down regulated and it was up-regulated at 48 h, the difference was significant (P<0.05). This study proved thatTrichinellaspiralisinfection can cause changes MR on dendritic cells and it is indicated that MR may be the recognition receptor of ES antigen. With the research of dendritic cell vaccine, this study can provides support to DC vaccine of Trichinella spiralis and immune escape mechanism research of parasite.

MR；Trichinellaspiralis；dendritic cell

國家“863”計劃項目(2013AA102806，2011AA10A215)；國家自然科學(xué)基金項目(31272552)

劉博宇，碩士，從事動物寄生蟲免疫學(xué)研究。

楊桂連。 E-mail：yangguilian@jlau.edu.cn。

2015-07-13

A

1002-1280 (2015) 10-0042-04

S852.7