阪崎克羅諾桿菌的ITS 序列分析

牛婕婷 ，滿朝新，費(fèi) 鵬，婁彬彬，李 然，柴云雷，李 理，姜毓君，

(1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院/乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030;2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)/國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150028)

阪崎克羅諾桿菌(原名阪崎腸桿菌)是一種革蘭氏陰性無芽孢的兼性厭氧菌，屬于條件致病菌［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，新生兒，尤其是早產(chǎn)兒、低體重新生兒和出生小于28d 的新生兒為易感人群，它能引起新生兒菌血癥、小腸結(jié)腸炎和腦膜炎，致死率高達(dá)50%以上，并且幸存的患者經(jīng)常會(huì)留下嚴(yán)重的神經(jīng)后遺癥，而嬰兒配方奶粉是其主要的感染途徑［4-8］。

ITS (internal transcribed spacer)序列是位于操縱子上16S rDNA 與23S rDNA 間的一段間隔序列，它的長(zhǎng)度和序列變化較大，將其擴(kuò)增物進(jìn)行序列分析，可用于對(duì)細(xì)菌的不同生物型、菌株、種進(jìn)行分類鑒定［9］。ITS 序列鑒定與16S rDNA 序列鑒定相比具有更高的靈敏性，有研究表明，ITS 的進(jìn)化速率是16S rDNA 的10 倍，相比16S rDNA 序列ITS 在細(xì)菌不同種屬間存在更大的差異，因此能夠?qū)?xì)菌進(jìn)行鑒定分類［10，11］。本研究采用ITS 序列對(duì)37 株阪琦克羅諾桿菌進(jìn)行鑒定，并針對(duì)ITS序列進(jìn)行分析，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，并證實(shí)了阪琦克羅諾桿菌含不同功能基因(即tRNAile+ala以及tRNAglu)，為阪崎克羅諾桿菌的鑒定及ITS 基因的進(jìn)一步分析提供了可供參考的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

本試驗(yàn)所用菌株分離自2009—2012年期間不同地區(qū)生產(chǎn)的乳粉和嬰幼兒配方粉樣品，及某一濕法加工嬰幼兒配方粉生產(chǎn)企業(yè)的加工環(huán)境和成品，共計(jì)37 株阪崎克羅諾桿菌。

1.2 試驗(yàn)試劑與設(shè)備

1.2.1 試驗(yàn)試劑

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，北京天根生物技術(shù)有限公司;膠回收試劑盒，美國(guó)Omega 公司;零背景快速連接試劑盒，北京天根生物技術(shù)有限公司;胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)，青島海博生物有限公司;氨芐青霉素，Solarbio 公司。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)備

移液器(德國(guó)Eppondorf 公司)、振蕩器、高壓蒸汽滅菌鍋、精密電子天平、DHP-9272 型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、9700 PCR 擴(kuò)增儀、DYY-10C型電泳儀、UVP 凝膠成像系統(tǒng)、TGC-16G 型離心機(jī)、WHF-201BJ 型紫外可見透射反射儀、電熱恒溫水浴鍋、Bcn1360 型生物超凈工作臺(tái)(上海佳勝儀器制造有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

取出-80 ℃甘油保存的阪崎克羅諾桿菌的凍存管，將菌株恢復(fù)至室溫后，按2%的接種量接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)8～12 h 進(jìn)行活化，活化后即可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)如菌體DNA 的提取。

1.3.2 基因組總DNA 的提取

取新鮮活化好的菌液1 mL，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒使用說明書，對(duì)37 株經(jīng)API20E 鑒定為阪崎克羅諾桿菌的菌株進(jìn)行DNA 提取。

1.3.3 ITS 序列的擴(kuò)增

以ITS 序列通用引物16 S/p2:5'-CTTGTACACACCGCCCGTC-3' 和23 S/p7:5'-GGTACTTAGATGTTTCAGTTC-3'以37 株阪崎克羅諾桿菌全基因組DNA 為模板。50 μL 反應(yīng)體系:1.0 μL 引物16 S/p2 (10 μmol/L)，1.0 μL引物23 S/p7 (10 μmol/L)，5 μL 10×Buffer (含MgCl2)，2.0 μL dNTPs (10 mmol/L)，1.0 μL Pyrobest DNA Polymerase (2.5 U/μL)，2.0 μL DNA 模板(20～50 ng)，ddH2O 補(bǔ)加至50 μL。PCR 擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min;循環(huán)數(shù)為30 個(gè);72℃終延伸5min;最后4℃保存。用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。

1.3.4 膠回收

將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收試驗(yàn)，具體方法參照瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒使用說明書。

1.3.5 目的片段與克隆載體的連接

試驗(yàn)方法參照零背景快速連接試劑盒使用說明書。

1.3.6 轉(zhuǎn)化反應(yīng)

(1)制備含有氨芐青霉素終濃度100 μg/mL 的LB瓊脂糖平板。使用前，將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中，預(yù)熱至少20 min。

(2)將10 μL 連接產(chǎn)物全部加入到100 μL 的TOP 10 感受態(tài)細(xì)胞中(感受態(tài)細(xì)胞儲(chǔ)存于-70 ℃，使用時(shí)避免反復(fù)凍融)，操作過程在冰浴上完成，待感受態(tài)剛剛解凍時(shí)加入連接產(chǎn)物。輕輕混勻，冰浴30 min。

(3)將反應(yīng)后的混合物置于42 ℃水浴鍋中恒溫90 s，取出后立即放于冰浴中保持2～3 min，期間不要碰動(dòng)離心管。

(4)向離心管中加入500 μL 37 ℃預(yù)熱的LB (不含氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基，37 ℃空氣振蕩培養(yǎng)45 min，轉(zhuǎn)速為150 r/min。使質(zhì)粒上的相關(guān)抗性標(biāo)記基因表達(dá)，菌體復(fù)蘇。

(5)將離心管中的菌液混勻，用槍頭吸取100 μL菌液加到預(yù)熱的LB 瓊脂糖培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)上，用涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，待平板表面干燥后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h。

1.3.7 菌落PCR 鑒定

通過菌落PCR 試驗(yàn)證明質(zhì)粒為含有目的基因的重組質(zhì)粒。以菌落為模板，用槍頭在培養(yǎng)平板中隨機(jī)挑取3～6 個(gè)菌落分別進(jìn)行PCR 試驗(yàn)。以pZreoBack 載體特異引物23-mer:5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3' 和 24-mer:5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3'對(duì)PCR 引物進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。50 μL 反應(yīng)體系:1.0 μL 引物23-mer (10 μmol/L)，1.0 μL 引物24-mer(10 μmol/L)，5 μL 10 ×Buffer (含MgCl2)，2.0 μL dNTPs (10 mmol/L)，1.0 μL Pyrobest DNA Polymerase(2.5 U/μL)，2.0 μL 菌落DNA，ddH2O 補(bǔ)加至50μL。PCR 擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;循環(huán)數(shù)為30 個(gè);72℃終延伸5 min;最后4 ℃保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.3.8 ITS 基因重組質(zhì)粒的測(cè)序

將檢測(cè)有目的條帶的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和引物序列送到上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Chromas 1.45 軟件進(jìn)行查閱，用DNAMAN 5.29軟件將雙向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行剪切與拼接，并將拼接后的序列在NCBI 上進(jìn)行Blast 序列比對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)菌株的鑒定，利用MEGA 4 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS 序列的擴(kuò)增

采用ITS 序列擴(kuò)增通用引物16S/p2 和23S/p7，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示。

圖1 ITS 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖

電泳結(jié)果顯示，阪崎克羅諾桿菌的ITS 序列不唯一，有兩條條帶，條帶大小在600～800 bp 之間。高旗利［12］等對(duì)阪崎克羅諾桿菌16S—23SrDNA 序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)阪崎克羅諾桿菌在rRNA 基因中有兩種操縱子，分別含有功能基因tRNAglu和功能基因tRNAile+ala，這與本研究結(jié)果相符，所以應(yīng)采用克隆實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR 產(chǎn)物的分離，并對(duì)每個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。

2.2 ITS 基因片段的膠回收

使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示。電泳結(jié)果顯示，在預(yù)期大小的位置出現(xiàn)了ITS 基因條帶，且條帶單一清晰，可用于后期與載體的連接試驗(yàn)。

圖2 ITS 基因膠回收電泳圖

2.3 重組質(zhì)粒的篩選

將膠回收的目的基因與pZeroBack 載體進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到Top 10 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)。由于該載體含有致死的限制性酶基因(內(nèi)含多克隆位點(diǎn))，多克隆位點(diǎn)插入外源片段會(huì)引起酶基因失活。而無外源片段插入的載體表達(dá)致死的限制酶，所以轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中會(huì)將細(xì)胞殺死。因此只有含目的基因的重組質(zhì)粒會(huì)在平板上存活形成菌落。

2.4 菌落PCR 的鑒定

隨機(jī)挑取平板上形成的菌落，作為PCR 反應(yīng)模板，以引物23-mer 和24-mer 作為擴(kuò)增引物。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電泳結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 重組質(zhì)粒pZeroBack:ITS 的PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.5 ITS 基因序列的測(cè)定

同樣將37 株分離菌株的ITS 基因(目的基因與載體的結(jié)合)的PCR 產(chǎn)物送到上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast 比對(duì)后，同樣結(jié)果顯示，所有菌株(包括ES59)除了ES4 以外，其余菌株與Cronobacter sakazakii 的同源性最高，相似性達(dá)99%，進(jìn)一步證明所有分離菌株(除ES4)均為阪崎克羅諾桿菌。而同樣ES4 被鑒定為弗氏檸檬酸桿菌。另外，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在36 株阪崎克羅諾桿菌中，31株菌的測(cè)序結(jié)果顯示ITS 基因含有tRNAglu功能基因，其余5 株菌的ITS 基因含有功能基因tRNAile+ala，說明G-ITS 基因?yàn)橹饕狪TS 基因類型。有文獻(xiàn)報(bào)道［13］，阪崎克羅諾桿菌共有7 個(gè)操縱子，其中4 個(gè)操縱子屬于G-ITS 類型，3 個(gè)操縱子屬于IA-ITS 類型。

2.6 ITS 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹及分析

以36 株阪琦克羅諾桿菌序列及已知標(biāo)株C.sakazakiiATCC12868、C.sakazakiiATCC29004、C.sakazakii-ATCC29544、E.aerogenes KCCM11783、K.pneumonia ATCC10031、S.enteric M495 等的序列為研究對(duì)象，利用MEGA 4.1 軟件分別對(duì)這兩種ITS 基因類型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，參數(shù)設(shè)置為鄰接相鄰算法，Kimura 2-parameter 模式，重復(fù)次數(shù)為1 000次。

由試驗(yàn)得出，5 株分離菌株與阪崎克羅諾桿菌ATCC 標(biāo)準(zhǔn)菌株(含tRNAIle和tRNAAla)在同一系統(tǒng)發(fā)育分支下，與鑒定結(jié)果相符。將分離菌株與ATCC 標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示，該群內(nèi)的同源性為99.29%。31 株分離菌株與阪崎克羅諾桿菌ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株(含tRNA-Glu)在同一系統(tǒng)發(fā)育分支下，腸桿菌科的其它菌株組成另一系統(tǒng)發(fā)育分支。將分離菌株與ATCC 標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示該群內(nèi)的同源性為98.15%。

結(jié)果表明，36 株分離菌株共有31 株菌的ITS 序列含有功能基因tRNAgul，5 株菌含有功能基因tRNAile+ala，說明含有tRNAgul功能基因的ITS 序列是阪崎克羅諾桿菌其基因的主要類型。對(duì)這兩種基因類型分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，這兩棵發(fā)育樹中的分離菌株都位于同一類群(Group I)，并且對(duì)群內(nèi)菌株間基因同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)無法對(duì)群內(nèi)菌株進(jìn)一步分型。分析原因是一方面阪崎克羅諾桿菌的ITS 序列比較保守。另一方面，在試驗(yàn)中同樣采用了通用引物對(duì)ITS 序列進(jìn)行擴(kuò)增，降低了菌株間序列的差異性。因此后續(xù)可通過設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)該序列測(cè)定分析，進(jìn)一步分析研究。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用ITS 序列基因測(cè)序的方法對(duì)37 株經(jīng)API20E 生化鑒定為阪崎克羅諾桿菌的分離株進(jìn)行了進(jìn)一步的鑒定分析，結(jié)果表明，已ITS 序列測(cè)序進(jìn)行阪崎克羅諾桿菌的鑒定更具準(zhǔn)確性。此外本試驗(yàn)通過進(jìn)一步的ITS 序列分析，發(fā)現(xiàn)了ITS 序列含有功能基因tRNAgul和功能基因tRNAile+ala兩種功能基因，且功能基因tRNAgul占優(yōu)勢(shì)地位?；谝陨涎芯空f明，ITS 序列可作為阪崎克羅諾桿菌的標(biāo)記性基因，用于對(duì)阪崎克羅諾桿菌的鑒定和快速檢測(cè)的研究，這部分研究?jī)?nèi)容也為ITS 序列數(shù)據(jù)庫(kù)的豐富及在細(xì)菌分類鑒定積累了經(jīng)驗(yàn)。

［1］FARMER，J.J.，et al.Enterobacter sakazakii:a new species of“Enterobacteriaceae”isolated from clinical specimens［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1980，30(3):569-584.

［2］JOSEPH S，CETINKAYA E，DRAHOVSKA H，et al.Cronobacter condimenti sp.nov.，isolated from spiced meat and Cronobacter universalis sp.nov.，a novel species designation for Cronobacter sp.genomospecies 1，recovered from a leg infection，waterand food ingredients ［J］.Int J Syst Evol Microb，2012，62:1277-1283.

［3］Healy，B.，et al.Cronobacter (Enterobacter sakazakii):an opportunistic foodborne pathogen ［J］.Foodborne Pathogens and Disease，2010.7(4):339-350.

［4］裴曉燕，劉秀梅，等.阪崎腸桿菌的生物學(xué)性狀與健康危害［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2005，16(6):550-555.

［5］Muytjens H L，Zanen H C，Sonderkamp H J，et al.Analysis of eight cases of neonatal meningitis and sepsis due to Enterobacter sakazakii ［J］.Journal of Clinical Microbiology，1983，18(1):115-150.

［6］Joint FAO/ WHO workshop on Enterobacter sakazakii and other microorganisms in powdered infant formula，Geneva，2-5.February 2004.

［7］Biering，G.，Karlsson，S.，Clark，N.C.，Jónsdóttir，K.E.，Lúdvígsson，P.，Steingrímsson，O.Three cases of neonatal meningitis caused by Enterobactersakazakii in powdered milk ［J］.Journal of Clinical Microbiology，1989，27:2054-2056.

［8］Control，C.f.D.and Prevention，Enterobacter sakazakii infections associated with the use of powdered infant formula--Tennessee ［J］.Morbidity and Mortality Weekly Report，2002，51(14):297-300.

［9］Gurtler V，Stanisich VA.New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region［J］.Microbiology，1996，142:3-16.

［10］Leblond-Bourget N，Philippe H，Mangin I，Decaris B.16S rRNA and 16S to 23S internal transcribed spacer sequence analyses reveal inter-and int raspecific Bif idobac terium phylogeny ［J］.In t J Syst Bacteriol，1996，46:102-111.

［11］Gurtler V，Stanisich VA.New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region ［J］.Microbiology，1996，142:3-16.

［12］高旗利，張霞，等.奶粉中阪崎腸桿菌PCR 檢測(cè)方法研究［J］.檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2005，15(4):4-8.

［13］Min Wang，Boyang Cao，et al.Detection of Enterobactersakazakii and Other Pathogens Associated with Infant Formula Powder by Use of a DNA Microarray ［J］.Journal of Clinical Microbiology，2009，47(10):3178-3184.