HPLC法測定不同生長年限的葛根不同部位中葛根素的含量Δ

劉計(jì)權(quán)，宋 強(qiáng)，楊文珍，任劍鋒，宋曉春（山西中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，太原 030024）

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）的干燥根，味甘、辛、涼，歸脾、胃經(jīng)，具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒等功效[1]。葛根的主要有效成分葛根素有多重藥理作用?，F(xiàn)代藥理及臨床研究表明，葛根素具有明顯的擴(kuò)張血管作用，臨床上廣泛應(yīng)用于治療缺血性心肌病、腦血栓、視網(wǎng)膜動靜脈栓塞[2-3]，以及由糖尿病引起的微循環(huán)障礙等[4-8]。葛根有效成分的形成和積累，不僅受其遺傳基因、生長環(huán)境的影響，同時也與其生長年限、器官與組織部位有著密切關(guān)系[9]。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法測定了不同生長年限的葛根不同部位中葛根素的含量，以期為葛根藥材的規(guī)范化栽培和加工利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

515型HPLC儀，包括515型輸液泵、2996型紫外檢測器（美國Waters公司）；EL204型萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH.S21-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試劑

葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110752-200912）；甲醇為色譜純，乙醇為分析純，水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.3 藥材

葛根藥材采自山西省平陸縣葛根種植基地，經(jīng)山西中醫(yī)學(xué)院劉計(jì)權(quán)副教授鑒定為豆科植物野葛P.lobata（Willd.）的根和莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diakma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（25 ∶75，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；檢測波長：250 nm。高效液相色譜見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取葛根素對照品1.8 mg，置于10 ml量瓶中，加30%乙醇溶解并定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后密封，得質(zhì)量濃度為0.18 mg/ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取葛根樣品適量，粉碎，過3號篩，精密稱取約0.2 g，置于圓底燒瓶中，精密加入30%乙醇50 ml，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再次精密稱定，用30%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液1、3、5、8、11 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以葛根素的進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝768 452x－316 936（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，葛根素的進(jìn)樣量在0.18～1.98 μg范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取葛根素對照品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備對照品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，葛根素峰面積的RSD為1.88%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，分別于放置0、2、4、6、8、10 h時，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，葛根素峰面積的RSD為1.08%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批葛根樣品（一年生葛根韌皮部）約0.2 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，葛根素峰面積的RSD為2.39%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的葛根樣品（一年生葛根韌皮部）約0.1 g，共6份，分別精密加入葛根素對照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.8 樣品含量測定

分別取不同的葛根樣品粉末適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)3次，記錄峰面積，計(jì)算葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，總體來講，木質(zhì)部中葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞韌皮部＞莖部，木質(zhì)部與韌皮部中葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較接近，而莖部質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于木質(zhì)部與韌皮部；但二年生葛根韌皮部中葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于四、五年生葛根木質(zhì)部。對于不同生長年限的葛根，木質(zhì)部中葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著生長年限有增長之勢；但到第三年時，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大，四到五年生葛根木質(zhì)部中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所下降；韌皮部中葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與木質(zhì)部呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，但韌皮部中葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從第3年就開始有所下降；葛根莖部中葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著生長年限的增長一直呈現(xiàn)增長趨勢。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

筆者在進(jìn)行樣品提取時發(fā)現(xiàn)，葛根韌皮部提取液的顏色較木質(zhì)部深，但含量測定結(jié)果顯示木質(zhì)部中葛根素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于韌皮部，可見提取液顏色的深淺與質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有必然聯(lián)系。

在提取過程中考慮到不同浸泡時間可能會導(dǎo)致葛根素在乙醇中的浸出率不同，為此筆者進(jìn)行了不同浸泡時間（直接提取、浸泡20 min、浸泡40 min）對葛根素質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的對比研究。結(jié)果，葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.91%、2.93%和2.94%，以浸泡40 min后葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，但差異不大?？紤]到提取效率，本研究最終確定采用直接提取的方式。

同一生長年限的葛根木質(zhì)部中葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于葛根韌皮部，分析其原因可能是葛根韌皮部外圍的木栓層在總質(zhì)量中占有一定的比例，從而導(dǎo)致韌皮部中葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低。因此，在葛根初加工時，將葛根表面的粗皮（木栓層）刮去，可提高葛根中葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[10]。

綜上所述，該方法操作簡單、結(jié)果可靠，適用于葛根藥材的質(zhì)量控制。由含量測定結(jié)果可知，葛根適宜的采收期應(yīng)確定在第2～3年；葛根莖部中葛根素的含量較少，不宜入藥。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：312.

[2]劉圣，張小力，余娜，等.葛根素對早期糖尿病腎病大鼠腎組織病理變化與BMP-7蛋白及mRNA表達(dá)的影響[J].中國藥房，2013，24（3）：196.

[3]劉計(jì)權(quán)，劉亞明，裴香萍，等.山西產(chǎn)葛根總黃酮及3種異黃酮含量的測定[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（2）：309.

[4]楊志勇.葛根醇提物對糖尿病模型大鼠血脂與血管的保護(hù)作用[J].中國藥房，2013，24（43）：4 063.

[5]唐洪梅，柴玉娜，涂星，等.丹參聯(lián)合葛根對糖尿病眼病模型大鼠的協(xié)同作用[J].中國藥房，2014，25（11）：977.

[6]李燕燕，邊寶林，楊健，等.葛根丹參膠囊成型工藝的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14（4）：22.

[7]王金萍，曾明，邊佳明，等.葛根復(fù)方對創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)整作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2007，13（3）：50.

[8]陳麗紅，唐于平，王強(qiáng).葛根芩連配方顆粒提取工藝研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（14）：4.

[9]郭巧生.藥用植物栽培學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2004：45.

[10]王書林.藥用植物栽培技術(shù)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2006：443.