HPLC法測定鹽酸替羅非班原料藥的含量及有關(guān)物質(zhì)

吳 燕，周 敏，張福成（解放軍空軍總醫(yī)院，北京 100142）

抗血小板治療在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病治療中起著十分重要的作用。鹽酸替羅非班是一種非肽類的血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體（該受體是與血小板聚集過程有關(guān)的主要血小板表面受體）的可逆性拮抗藥，可阻止纖維蛋白原與糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體結(jié)合，從而阻斷血小板的交聯(lián)及血小板的聚集[1-3]。鹽酸替羅非班可抑制二磷酸腺甘誘導(dǎo)的血小板聚集及延長出血時(shí)間，可強(qiáng)效抑制血小板功能，作用顯著，特異性強(qiáng)。目前，關(guān)于鹽酸替羅非班原料藥和注射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未見文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究建立了以高效液相色譜（HPLC）法測定鹽酸替羅非班原料藥的含量及有關(guān)物質(zhì)的方法。

1 材料

LC-10AD HPLC儀，包括SPD-10AVP檢測器、CLASSLC 10A色譜工作站（日本島津公司）；AE-240萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

鹽酸替羅非班對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100646-200401，純度：99.9%）；鹽酸替羅非班原料藥（解放軍空軍總醫(yī)院自制，批號(hào)：201230601、201230602、201230603，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.5%、99.6%、99.7%）；鹽酸替羅非班中間體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（解放軍空軍總醫(yī)院自制，批號(hào)均為：201230601，純度分別為：99.4%、99.5%、99.4%）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為屈臣氏水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.1%醋酸銨溶液（pH 2.30）-乙腈-甲醇（90 ∶5∶5，V/V/V），流動(dòng)相B為0.1%醋酸銨溶液（pH 2.30）-乙腈-甲醇（10 ∶85 ∶5，V/V/V），梯度洗脫程序見表1；檢測波長：227 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10μl。

2.2 含量測定方法

取樣品（批號(hào)：201230601）適量，用流動(dòng)相B定量稀釋制成0.1 mg/ml的溶液，作為供試品溶液，精密量取10μl進(jìn)樣測定；另取鹽酸替羅非班對照品適量，同法制備對照品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

圖1 高效液相色譜圖A.對照品溶液；B.供試品溶液；1.鹽酸替羅非班Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；1.tirofiban hydrochloride

2.3 有關(guān)物質(zhì)測定方法

取樣品（批號(hào)：201230601）適量，加流動(dòng)相B稀釋制成1 mg/ml的溶液，作為供試品溶液；精密量取1 ml，置于100 ml量瓶中，加流動(dòng)相B稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。取對照溶液10 μl注入HPLC儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰高約為滿量程的20%；再精密量取供試品溶液與對照溶液各10 μl，分別注入HPLC儀，記錄色譜，詳見圖2。供試品溶液的色譜圖中如有雜質(zhì)峰，按自身對照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的量。

圖2 有關(guān)物質(zhì)測定和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖A.空白溶劑（水）；B.系統(tǒng)適用性溶液；C.供試品溶液；D.對照溶液；1.中間體Ⅰ；2.中間體Ⅲ；3.中間體Ⅱ；4.鹽酸替羅非班Fig 2 HPLC chromatograms of related substance and system suitabilityA.blank solvent（water）；B.system suitability solution；C.test sample；D.substance control；1.intermediateⅠ；2.intermediate Ⅲ；3.intermediateⅡ；4.tirofiban hydrochloride

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別稱取鹽酸替羅非班中間體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 mg，置于10 ml量瓶中，用流動(dòng)相B定容，得系統(tǒng)適用性貯備液；精密稱取樣品（批號(hào)：201230601）100 mg，置于100 ml量瓶中，精密移取系統(tǒng)適用性貯備液1 ml置于此量瓶中，定容，搖勻，得系統(tǒng)適用性溶液。量取系統(tǒng)適用性溶液10 μl注入HPLC儀，記錄色譜，詳見圖2。結(jié)果表明，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，鹽酸替羅非班與各中間體及各個(gè)中間體之間的分離度均＞1.5，分離度良好。

2.5 方法專屬性考察

取樣品（批號(hào)：201230601）約25 mg，精密稱定，共5份，分別置于25 ml量瓶中：1份加入2 mol/L鹽酸溶液1 ml，放置1 h；1份加入30%過氧化氫溶液1 ml，放置2 h；1份加入流動(dòng)相1 ml使溶解，在強(qiáng)光4 500 lx下照射4 h；1份加入流動(dòng)相1 ml使溶解，并在100 ℃水浴中加熱2 h；1份加入2 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml，放置1 h。上述5份溶液分別用流動(dòng)相B稀釋至刻度，搖勻，各量取10 μl，分別注入HPLC儀，記錄色譜，詳見圖3。結(jié)果表明，樣品在酸、堿、氧化、高溫和光照條件下均保持相對穩(wěn)定，各破壞條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物峰與主峰均能達(dá)到基線分離，且各雜質(zhì)間的分離度良好。

圖3 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖A.酸破壞樣品；B.堿破壞樣品；C.氧化破壞樣品；D.高溫破壞樣品；E.光照破壞樣品；F.未破壞樣品；1.鹽酸替羅非班Fig 3 HPLC chromatograms of specificity testA.sample destroyed by acid；B.sample destroyed by alkali；C.sample destroyed by oxidation；D.sample destroyed by high temperature；E.sample destroyed by illumination sample；F.undestroyed sample；1.tirofiban hydrochloride；

2.6 線性關(guān)系考察

取鹽酸替羅非班對照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相B溶解并稀釋制成每1 ml中約含1 000 μg的線性貯備液；分別取鹽酸替羅非班中間體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ適量，精密稱定，分別加流動(dòng)相B溶解并稀釋制成每1 ml中各約含100 μg的線性貯備液。分別精密量取上述各線性貯備液適量，用流動(dòng)相B按逐級稀釋的方法制成系列濃度溶液，測定峰面積，以峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x，μg/ml）進(jìn)行線性回歸，回歸方程和線性范圍見表2。

2.7 檢測限和定量限

分別取“2.6”項(xiàng)下鹽酸替羅非班中間體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ線性貯備液適量，均采用逐步稀釋法稀釋至0.05 μg/ml，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，以信噪比3計(jì)算得3個(gè)中間體的最低檢測限均為0.5 ng；以信噪比10計(jì)算得3個(gè)中間體的定量限均為2.0 ng。

表2 鹽酸替羅非班及其中間體的回歸方程和線性范圍Tab 2 The regression equation and linear range of tirofiban hydrochloride and intermediates

2.8 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下的鹽酸替羅非班對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜，結(jié)果鹽酸替羅非班峰面積的RSD為0.35%，表明儀器精密度良好。取樣品（批號(hào)：201230601）適量，平行6份，按“2.2”項(xiàng)下方法處理制備含量測定供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，得平均含量為99.8%，鹽酸替羅非班峰面積的RSD為0.19%，表明本方法重復(fù)性良好。取“2.2”項(xiàng)下含量測定供試品溶液（批號(hào)：201230601）適量，平行6份，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣測定，計(jì)算得到鹽酸替羅非班峰面積的RSD為0.33%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

取鹽酸替羅非班對照品約8、10、12 mg，各3份，精密稱定，分別置于100 ml量瓶中，加流動(dòng)相B使其溶解，定容，搖勻，進(jìn)樣測定，記錄色譜，計(jì)算回收率，結(jié)果詳見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 3 Results of recovery test（n＝3）

2.10 樣品測定

取對照品和3批樣品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法處理并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算含量；取3批樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣測定，計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的量（各單個(gè)雜質(zhì)均不得過0.2%，總雜質(zhì)不得過0.6%），結(jié)果見表4。

3 討論

表4 樣品測定結(jié)果（n＝3）Tab 4 Results of sample determination（n＝3）

3.1 流動(dòng)相的選擇[4-5]

本試驗(yàn)在篩選流動(dòng)相過程中，曾設(shè)計(jì)了多組不同組成的流動(dòng)相體系（磷酸鹽-乙腈，辛烷/磷酸鹽-乙腈，醋酸鹽-甲醇，醋酸鹽-甲醇/乙腈等），通過對每個(gè)組成的流動(dòng)相體系進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)醋酸銨-甲醇/乙腈體系按本試驗(yàn)比例混合后能滿足分析要求。同時(shí)，緩沖液的pH對峰形和分離度也有較大的影響：隨著pH的降低，鹽酸替羅非班與各中間體及雜質(zhì)的分離度增加，且峰形較尖銳。但考慮到色譜柱的耐酸性及使用壽命，最終確定流動(dòng)相pH為2.30。

3.2 梯度洗脫程序的確定[6-7]

鹽酸替羅非班與其3個(gè)中間體結(jié)構(gòu)較相似，出峰時(shí)間較接近，因此選擇合適的梯度洗脫方式才能達(dá)到分離度要求。中間體Ⅰ與中間體Ⅲ相鄰較近，難以分開，故將此處的梯度變緩；而鹽酸替羅非班與中間體Ⅱ之間沒有其他雜質(zhì)，故調(diào)節(jié)此處梯度變化，使中間體Ⅱ快速出峰，以節(jié)省洗脫時(shí)間。通過對梯度的調(diào)整，在表1所示梯度洗脫程序下，主成分與各中間體、雜質(zhì)均能達(dá)到有效分離，且各峰純度都達(dá)100%。故選擇此梯度洗脫程序進(jìn)行洗脫。

3.3 色譜柱的選擇[8-10]

在選定流動(dòng)相系統(tǒng)下，對CAPCELL柱、Thermo和Varian鍵合相柱進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用Thermo鍵合相柱分析時(shí)，中間體Ⅰ與中間體Ⅲ不能實(shí)現(xiàn)良好分離；而采用Varian鍵合相柱分析時(shí)峰形較差，且流動(dòng)相的pH接近其耐酸值極限。故最終采用CAPCELL PAK C18為本研究的色譜柱。

綜上所述，該方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，適用于鹽酸替羅非班原料藥的含量及有關(guān)物質(zhì)測定。

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