橘核的HPLC指紋圖譜研究及聚類分析

羅 靜，何中燕，裴 瑾，康亞蘭，劉 薇（.成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 637；2.四川科倫藥物研究院有限公司，成都 6007）

橘核為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟種子，具有理氣、散結(jié)、止痛的功效，臨床主要用于治療急性乳腺炎、乳腺增生[1]等疾病，具有較高的藥用價(jià)值[2-3]。有研究表明，橘核的主要有效組分為檸檬苦素類似物[4]，該類化合物具有抗腫瘤[5-6]、抗病毒[7]、鎮(zhèn)痛、消炎、催眠鎮(zhèn)靜[8]等多種作用，有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

柑橘屬植物也是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，該屬的分類、進(jìn)化和重要栽培（雜）種的起源等問題目前尚沒有統(tǒng)一的觀點(diǎn)[9]。2010年版《中國(guó)藥典》（一部）僅收載了橘核的“性狀”“橫切面鑒別”等項(xiàng)的鑒別方法[10]，尚無全面的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。為此，本研究收集了廣西玉林、河北安國(guó)、成都荷花池、安徽亳州等國(guó)內(nèi)幾個(gè)主要藥材市場(chǎng)的11批橘核樣品以及7批不同品種的自采橘核樣品，采用高效液相色譜（HPLC）法建立了不同產(chǎn)地、不同品種18批橘核藥材的指紋圖譜[11]，以期為橘核的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀，配有DAD二極管陣列檢測(cè)器、Chemstation色譜工作站（美國(guó)安捷倫公司）；KQ 5200E型超聲機(jī)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；千分之一電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑

檸檬苦素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110800-201205）；諾米林對(duì)照品（四川維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：121010，純度≥98%）；乙腈為色譜純，石油醚、甲醇為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

18批橘核藥材來源見表1。所有藥材樣品均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥植與鑒定教研室裴瑾教授鑒定為橘C.reticulataBlanco或其栽培變種的干燥成熟種子。

表1 18批橘核藥材來源Tab 1 Source of 18 batches ofC.reticulate

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.3%磷酸水溶液，梯度洗脫程序見表2；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取檸檬苦素、諾米林對(duì)照品各適量，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取橘核樣品粉末（過3號(hào)篩）約1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入石油醚（60～90 ℃）20 ml，超聲脫酯20 min后，棄去石油醚液，殘?jiān)蛹状?0 ml，超聲提取30 min，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液、對(duì)照品溶液及甲醇各20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品溶液與對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間處有相同的色譜峰，溶劑甲醇無干擾。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果，檸檬苦素、諾米林峰面積的RSD分別為1.03%、1.02%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，于制備0、2、4、8、12 h時(shí)分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，檸檬苦素、諾米林峰面積的RSD分別為1.70%、1.29%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批橘核藥材樣品（JH07）共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，檸檬苦素、諾米林峰面積的RSD分別為1.85%、1.66%，表明本法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 指紋圖譜的測(cè)定 取18批橘核藥材樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得特征指紋色譜峰，詳見圖1。將不同批次橘核藥材的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（研究版），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，18批橘核藥材共有的特征峰有11個(gè)。以檸檬苦素參照物為內(nèi)標(biāo)，確定檸檬苦素（9號(hào)峰）為參照峰。樣品指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積值分別見表3、表4。

圖1 特征指紋色譜峰Fig 1 Common peaks of HPLC fingerprint

表3 樣品指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 3 Relative retention time of fingerprint common peak

2.4.2 相似度分析 18批橘核藥材的HPLC指紋圖譜見圖2。經(jīng)計(jì)算，各個(gè)樣品圖譜與對(duì)照品圖譜的相似度均＞0.90，表明所建立的指紋圖譜技術(shù)指標(biāo)穩(wěn)定、重復(fù)性好，不同產(chǎn)地橘核的主成分基本相同。相似度分析結(jié)果見表5。

2.4.3 聚類分析 以歐氏距離作為相似程度指標(biāo)，對(duì)18批橘核樣品色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用類平均法為聚類方法對(duì)樣品進(jìn)行歸類，結(jié)果見圖3。

由圖3可見，橘核藥材依據(jù)其指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積被聚為兩大類：第一大類包括所有市售橘核樣品（JH01～JH11）。第二大類為自采橘核樣品（JH12～JH18）。說明采集方式的不同對(duì)橘核藥材各成分的含量有影響。第一大類又被聚為兩組，第一組包括廣東、四川、江西等地所產(chǎn)的橘核樣品，第二組包括廣西、湖南、江蘇、浙江等地所產(chǎn)的橘核樣品?？梢?，不同產(chǎn)地的土壤、海拔和其他氣候條件等對(duì)于橘核中有效成分檸檬苦素和諾米林的含量有一定的影響。第二大類又被聚為兩組，第一組為椪柑的種子，第二組為福橘的種子，表明不同品種柑橘的種子在檸檬苦素和諾米林的含量上也顯示出差異。

表4 樣品指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積值Tab 4 Relative peak area of fingerprint common peak

圖2 18批橘核藥材的HPLC指紋圖譜S1～S18.1～18批橘核藥材；R.對(duì)照?qǐng)D譜Fig 2 Fingerprint of 18 batches ofC.reticulateS1-S18.1-18 batches ofC.reticulate；R.reference fingerprint

表5 18批橘核藥材的相似度分析結(jié)果Tab 5 Analysis of the similarity of 18 bacthes ofC.reticulate

圖3 18批橘核藥材HPLC指紋圖譜的聚類分析樹狀圖Fig 3 Cluster analysis of HPLC fingerprint of 18 batches ofC.reticulate

3 討論

由于橘核藥材中含檸檬苦素、黃酮類等成分，因此本研究將橘核樣品經(jīng)石油醚脫酯、甲醇提取后，制備成供試品溶液注入HPLC儀進(jìn)樣分析。筆者曾選擇210、254、300 nm等波長(zhǎng)對(duì)橘核樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)的色譜圖基線平穩(wěn)、分離效果好、峰數(shù)較多，所反映的化學(xué)信息較多；而其他波長(zhǎng)檢測(cè)到的色譜圖有基線漂移現(xiàn)象。因此，本研究最終選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。因橘核藥材所含成分較為復(fù)雜，各種類型的化合物極性差別較大，故本研究采用梯度洗脫的方式。筆者曾比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.3%磷酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明采用乙腈-0.3%磷酸水溶液梯度洗脫可使樣品得到更好的分離，且色譜峰峰形較好，故選用該系統(tǒng)為流動(dòng)相。

綜上所述，本研究所收集的18批橘核樣本的HPLC指紋圖譜較為相似，說明橘核藥材在化學(xué)成分上比較穩(wěn)定；用于指紋圖譜分析的藥材的共有色譜峰相似系數(shù)均在0.90以上，表明本研究結(jié)果可作為橘核藥材的鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)的依據(jù)。

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