柑橘籽中檸檬苦素及類似物的生物活性研究進(jìn)展

晏敏，周宇，賀肖寒，梅明鑫，董全

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

我國是世界上柑橘第一生產(chǎn)大國， 2015年全國柑橘總產(chǎn)量高達(dá)3.6×107t，并且呈逐年遞增趨勢，但柑橘加工利用程度卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，許多柑橘資源還未能得到充分地開發(fā)利用。柑橘籽具有顯著的抗糖尿病、低膽固醇血癥和降血脂活性[1]，在臨床領(lǐng)域主要是用于治療急性乳腺炎、肝癌和乳腺增生等疾病[2]。其有效組分主要是檸檬苦素類化合物。檸檬苦素類化合物是一類具有呋喃環(huán)并且高度氧化的四環(huán)三萜類次生代謝產(chǎn)物[3]，該類物質(zhì)具有抗腫瘤[4]、鎮(zhèn)痛消炎[5]、抗焦慮鎮(zhèn)靜、殺蟲和抗氧化等生物活性[6]。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了300多種檸檬苦素類化合物[7]，在柑橘類果實(shí)的核、囊衣和內(nèi)果皮等部位含量豐富[8]，柑橘籽中檸檬苦素含量高達(dá)3 200.0 mg/kg[9]。檸檬苦素類化合物除了用作藥物以外，還可以作為保健品和天然食品添加劑廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[10]，也可以用作天然殺蟲劑以及動物飼料添加劑。本文就近年來國內(nèi)外對柑橘籽中檸檬苦素及類似物的生物活性研究進(jìn)展進(jìn)行了評述，并對其發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

1 柑橘籽中檸檬苦素類化合物的種類及結(jié)構(gòu)及合成途徑

1.1 檸檬苦素類化合物的種類及結(jié)構(gòu)

檸檬苦素類化合物(limonoids)是一類含有4,4,8-三甲基-17-呋喃基甾體基本骨架結(jié)構(gòu)的化合物[7, 11]。檸檬苦素類化合物在蕓香科植物中主要分為苷元型檸檬苦素類、糖苷型檸檬苦素類和降解型檸檬苦素類[12]。目前從蕓香科中分離得到了71個檸檬苦素苷元類化合物，21個檸檬苦素糖苷型類化合物，13個檸檬苦素降解型類化合物[13]。檸檬苦素苷元類化合物有5種類型，完整四環(huán)骨架型(如7-de ac-etylazadirone)，A環(huán)開裂型(如7-deacetylproceranone和kihadalactoneA)，A、D環(huán)開裂型(如atalantolide和obacunoic acid)，B、D環(huán)開裂型(如hortiolideA和hortiolideB)和A、B、D環(huán)開裂型(如deoxylimonic acid)(圖1)。

圖1 檸檬苦素苷元類化合物Fig.1 Limonin aglycones

圖2 檸檬苦素糖苷類化合物Fig.2 Limonin glycosides

檸檬苦素糖苷類化合物是由檸檬苦素苷元在17位和一分子葡萄糖以糖苷鍵的形式結(jié)合而成的，如methyldeacetylnomilinate17-O-β-D-Glc、alamin17-O-β-D-Glc、obacunone17-O-β-D-Glc和nomilin17-O-β-D-Glc等(圖2)。檸檬苦素降解型類化合物是由檸檬苦素類化合物失去A、B環(huán)而形成的一類化合物，如calodendrolide、dictamdiolA、calodendrolide、dictamdiolB和dasycarpol等(圖3)[14]。

圖3 檸檬苦素降解型類化合物Fig.3 Degradation of limonoids

檸檬苦素(limonin)又稱吳茱萸內(nèi)酯，其分子式為C26H30O8，分子質(zhì)量為470.53[15]。檸檬苦素類化合物含有C-17與D-環(huán)連接的呋喃環(huán)，在C-3，C-4，C-7，C-16，C-17位均有含氧官能團(tuán)，除脫氧檸檬苦素外，C-14、C-15位上均有氧橋環(huán)[16]。它具有椅子配合的環(huán)己烷環(huán)(D)，環(huán)己酮和扭船構(gòu)象的兩個內(nèi)酯環(huán)(D，A和E)，呋喃(B)和環(huán)氧化物。此外，還存在具有平坦構(gòu)象的第二呋喃環(huán)(F)作為取代基[17]。檸檬苦素類化合物的存在形式有苷元和配糖體2種，苷元不溶于水且是引起后苦味的主要原因，而糖苷具有良好的水溶性且?guī)缀鯖]有苦味，在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿條件下能發(fā)生水解，生成相應(yīng)的苷元和葡萄糖[18]。主要的檸檬苦素類似物苷元有諾米林和奧巴叩酮，常見的檸檬苦素類似物配糖體有奧巴叩酮17-β-D-吡喃葡萄糖苷、檸檬苦素17-β-D-吡喃葡萄糖苷和諾米林17-D-β-吡喃葡萄糖苷等[16]。從柑橘屬植物中得到了38種檸檬苦素糖苷配基和20種檸檬苦素配糖體[19]，如存在于柑橘籽中的檸檬苦素、異檸檬苦酸(isolimonexic acid)、奧巴叩酮(obacunone)、諾米林(nomilin)、宜昌根(ichangin)、脫乙酰諾米林(dealcetrylnomilin)、諾米林酸(nomilin acid)、脫乙酰諾米林酸(dealcetrylnomilin acid)等。其中部分物質(zhì)的結(jié)構(gòu)見圖4。

圖4 柑橘籽中的檸檬苦素及其類似物Fig.4 Limonin and its analogues in citrus seeds

1.2 檸檬苦素的生物合成途徑

圖5 柑橘籽中檸檬苦素生物合成途徑Fig.5 Biosynthesis of limonin in citrus seed

檸檬苦素類化合物在無損壞的果實(shí)中以無苦味的檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯(limonoate A-ring lactone，LARL) 形式存在，果實(shí)受到損傷或榨汁后，在酸性條件下，經(jīng)過檸檬苦素D-環(huán)內(nèi)酯水解酶(limoninD-ring lactone hydrolase，LDRLase)的催化作用，LARL迅速轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)烈苦味的檸檬苦素[20]。生物合成檸檬苦素的前體物質(zhì)是乙酰輔酶A，其通過三步生物合成途徑生成甲羥戊酸。再經(jīng)過3個步驟得到二磷酸異戊酯(IPP)或其異構(gòu)體二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)。3個C5單位的IPP / DMAPP提供碳以構(gòu)成法呢基二磷酸酯(FPP)的支架，后者的2個C15單元最終得到角鯊烯(SQ)，是最接近柑橘類檸檬苦素類化合物的氫化物[15, 21-22]。由角鯊烯(SQ)合成諾米林后可以經(jīng)過4條途徑得到檸檬苦素類化合物，這4條途徑分別是檸檬苦素類群合成途徑、卡拉敏群合成途徑、宜昌根辛類群合成途徑和醋酸酯類群合成途徑[23]。柑橘籽中檸檬苦素是由角鯊烯(SQ)形成諾米林再經(jīng)檸檬苦素類群合成途徑得到奧巴叩酮，奧巴叩酸，最終合成檸檬苦素[7, 24]，見圖5。

2 檸檬苦素類化合物的生物活性

2.1 抗癌

柑橘籽中的某些化合物具有較強(qiáng)的抗癌活性，對淋巴癌、乳腺癌、口腔癌、腎癌及胃癌等多種癌細(xì)胞有顯著的抑制作用。其主要的生物活性成分是檸檬苦素類化合物，它可以通過清除自由基、激發(fā)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性、抑制致癌化學(xué)物質(zhì)的活性及抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來防治腫瘤。檸檬苦素類化合物含有的呋喃環(huán)是其具有抗癌活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[25]。

RAHMAN等[26]通過MTT法檢測了檸檬苦素對各種人類癌細(xì)胞的抗癌作用。結(jié)果表明，檸檬苦素是通過促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來使細(xì)胞凋亡，能顯著地抑制癌細(xì)胞的生長，其效果與檸檬苦素劑量有關(guān)。董秋月[27]從干燥的枳殼中得到了一種結(jié)構(gòu)新穎的檸檬苦素類化合物(I)(如圖6)。化合物(I)經(jīng)體外試驗(yàn)證明能夠抑制腎癌細(xì)胞增殖，并且抑制效果與濃度及時間有關(guān)。向羽[12]從柚類果實(shí)中提取純化的檸檬苦素和諾米林具有一定的抑制腫瘤細(xì)胞増殖的作用，諾米林[IC50為(63.3±7.6) mg/mL]能抑制白血病細(xì)胞增殖，且與其含量呈正相關(guān)。還有其他抗癌類型和相關(guān)活性物質(zhì)如表1所示。

圖6 結(jié)構(gòu)新穎的檸檬苦素類化合物(1)Fig.6 Structure of the new limonoids(1)

序號抗癌類型活性物質(zhì)作用途徑1胰腺癌檸檬苦素，檸檬酸，檸檬酸葡萄糖苷抑制Panc?28細(xì)胞，IC50值在18～42μmol/L范圍內(nèi)，有利于蛋白的細(xì)胞凋亡按照ILNANLNANSGNLimoninNLG的順序進(jìn)行表達(dá)[28]2雌激素反應(yīng)性乳腺癌(MCF?7)檸檬苦素，諾米尼酮，奧巴酮，檸檬苦酸，異檸檬苦酸胱天蛋白酶?7依賴途徑[29-30]3L5178Y淋巴瘤細(xì)胞檸檬苦素高細(xì)胞毒活性(IC50=8．5μg/mL)[31]4A毒素B1或抗DEN誘導(dǎo)的肝癌檸檬苦素抑制LPO和氧化應(yīng)激介導(dǎo)的自由基產(chǎn)生和調(diào)節(jié)抗氧化劑防御機(jī)制[32]5結(jié)腸癌檸檬苦素抑制β?連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，抑制腸息肉形成[33]6胃癌MKN45toonaciliatinA誘導(dǎo)移植瘤組織中caspase?3蛋白表達(dá)增加，抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[34]

2.2 抗病毒

檸檬苦素具有較好的抗病毒活性，如YAN等[35]使用2種方法對檸檬苦素對煙草花葉病毒(TMV)復(fù)制的抑制活性進(jìn)行測試，第一種方法是通過半葉法在抗煙草花葉病毒N.glutinosa染色體片段中測定化合物的感染抑制活性，另外一種方法是使用Western印跡分析來驗(yàn)證抑制煙草花葉病毒衣殼蛋白(TMV-CP)的積累。結(jié)果顯示，檸檬苦素對TMV具有較強(qiáng)的抑制活性，并且可以增加宿主植物對TMV感染的抗性。BALESTRIERI等[36]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬苦素對人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV-1)和HIV-1RT活性也有抑制作用。但是，檸檬苦素具有抗病毒特性的相關(guān)機(jī)理還不是很清楚，有待進(jìn)一步研究。

2.3 防治骨質(zhì)疏松癥

LEE等[37]研究表明,檸檬苦素刺激堿性磷酸酶(ALP)活性、礦化，并通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞中p38信號傳導(dǎo)來增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因的表達(dá)。在動物中，檸檬苦素能抑制大鼠卵巢切除術(shù)(OVX)誘導(dǎo)的體重增加，影響小梁骨結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)性質(zhì)，提高骨礦物質(zhì)的密度和含量。檸檬苦素對骨形成具有良好的作用，可用于研發(fā)具有防治骨質(zhì)疏松癥作用的膳食補(bǔ)充劑。

2.4 鎮(zhèn)痛消炎

有研究者證實(shí)了檸檬苦素類化合物具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛消炎的生物活性。如YANG等[38]研究表明,檸檬苦素類化合物3c(圖7)顯示出很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛和抗炎活性，其鎮(zhèn)痛活性比阿司匹林更大，其抗炎活性強(qiáng)于萘普生。李敬芳等[39]采用超聲提取陳皮中的檸檬苦素，并分析了檸檬苦素對小鼠植入棉球致肉芽腫和小鼠扭體產(chǎn)生的抑制作用。結(jié)果顯示，從陳皮中提取出的檸檬苦素對小鼠植入棉球致肉芽腫和扭體反應(yīng)有顯著的抑制作用，表明了檸檬苦素具有較強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛作用。檸檬苦素類化合物作為一種天然藥物成分，將會在醫(yī)藥行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景。

圖7 檸檬苦素類化合物3cFig.7 Limonin compounds 3c

2.5 護(hù)肝作用

在化學(xué)誘導(dǎo)肝損傷的情況下，已經(jīng)證實(shí)檸檬苦素具有抗炎癥和抗氧化特性。檸檬苦素可以通過降低乳酸脫氫酶，降低氧化應(yīng)激，降低和固縮肝細(xì)胞變性來改善實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)肝缺血再灌注的有害作用[40]。試驗(yàn)中大鼠在D-半乳糖胺(D-Gal N)注射前口服檸檬苦素，其肝臟損傷和肝炎，氧化應(yīng)激和Toll樣受體4(TLR-4)的表達(dá)顯著減弱。檸檬苦素(100 mg/kg)比膽紅素的效果更好。檸檬苦素低劑量(50 mg/kg)比高劑量(100 mg/kg)表現(xiàn)出更好的抗氧化應(yīng)激和肝臟結(jié)構(gòu)損傷。檸檬苦素通過減輕炎癥和減少氧化應(yīng)激，對炎癥和組織損傷相關(guān)的肝毒性發(fā)揮保護(hù)作用。

KELLEY等[41]在超重/肥胖個體的交叉，安慰劑對照，雙盲研究中確定了柑橘類檸檬苦素對慢性炎癥疾病如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、糖尿病和癌癥的循環(huán)生物標(biāo)志物的影響。柑橘類檸檬苦素能顯著降低肝臟蛋白質(zhì)的濃度：γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，堿性磷酸酶和補(bǔ)體C3。由于在代謝綜合征、NAFLD、糖尿病、慢性腎臟疾病和肝癌中肝臟酶會升高，柑橘類檸檬苦素可用于預(yù)防和治療此類疾病。HAN等[42]使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測了檸檬苦素對人類肝臟微粒體中主要的CYP同工酶活性的體外抑制作用。并且觀察到檸檬苦素對CYP3A4具有強(qiáng)烈抑制作用，IC50值為6.20l mol/L。

2.6 殺蟲活性

檸檬苦素類化合物能抑制昆蟲產(chǎn)卵的特性，如ERAKY等[43]通過給攜帶有吸血蟲的小鼠灌胃不同濃度的檸檬苦素來評估其治療效果。結(jié)果表明，在小鼠感染后，給予劑量為50或100 mg/kg的檸檬苦素可以明顯減少蠕蟲數(shù)量，小鼠腸組織中蛋載量分別下降了46.67%和56.1%，與卵死亡水平升高有關(guān)。檸檬苦素和諾米林還具殺蟲的活性，BILAL等[44]用含有檸檬苦素和諾米林的柑橘油對白紋伊蚊進(jìn)行處理，結(jié)果表明，檸檬苦素和諾米林的殺蟲效果都比較好，其IC50為297×10-6，死亡率為97%。因此，檸檬苦素類化合物可以作為一種天然的生物殺蟲劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)中，它不僅殺蟲效果好，而且安全無污染。

2.7 降低食欲和抗肥胖

最新的研究表明，檸檬苦素具有降低食欲和抗肥胖的作用，能夠明顯降低機(jī)體的能量攝入。YOON等[45]研究了加味劑刺激OST途徑中主要的第二信使Ca2+和cAMP增加，在非神經(jīng)元3T3-L1細(xì)胞中對檸檬苦素進(jìn)行預(yù)處理。檸檬苦素能顯著降低丁香酚誘導(dǎo)的Ca2+和cAMP水平和上調(diào)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)和cAMP依賴蛋白激酶(PKA)的磷酸化。它們能通過調(diào)節(jié)Ca2+和cAMP水平和CREB的磷酸化來抑制非神經(jīng)元細(xì)胞中的OST途徑，從而降低食欲。徐鐵山等[46]研究了檸檬苦素對牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中核纖層蛋白基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中添加檸檬苦素能夠?qū)εＧ绑w脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的程度起到顯著的抑制作用。LMNA 基因在牛前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平比較高，添加檸檬苦素后能夠降低LMNA基因表達(dá)水平。從而表明了檸檬苦素能夠抑制脂肪的形成。

2.8 其他方面的生物活性

檸檬苦素類化合物還可以防治動脈粥樣硬化，SAH等[1]用石油醚從CitrusmedicaLinn種子中提取檸檬苦素類物質(zhì)，并以大白鼠為受體，研究表明，檸檬苦素類物質(zhì)能明顯降低大鼠體內(nèi)血清膽固醇、血清甘油三酯的含量，增加高密度脂蛋白膽固醇(HDL)含量，這可以降低動脈粥樣硬化的發(fā)生。諾米林及其他檸檬苦素類似物具有抗氧化活性[47-48]。李林子等[49]研究表明，檸檬苦素可以使衰老模型小鼠的血清及其腦組織中脂褐素、丙二醛水平明顯降低，并且還能提高血清及腦組織中谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶的活力及腦組織中總抗氧化的能力。此外，檸檬苦素類化合物還具有抑菌等其他生物活性。

3 檸檬苦素類化合物的應(yīng)用

3.1 在食品中的應(yīng)用

檸檬苦素類化合物具有抗癌、降低膽固醇和抗腫瘤等活性，且它的配糖體水溶性好且無苦味，因此可以直接將其作為功能性食品添加劑加以利用。檸檬苦素類化合物的苷元水溶性差且能產(chǎn)生苦味，經(jīng)過合理的包埋處理后也可以用做功能性食品添加劑，其用途更加廣泛。在骨代謝中，檸檬苦素對骨形成具有良好的作用，可以作為防治骨質(zhì)疏松癥的功能性食物成分和膳食補(bǔ)充劑。檸檬苦素和諾米林具有較高的抗氧化生物活性，研究發(fā)現(xiàn)檸檬苦素與VC的抗氧化能力相當(dāng)，可以將其開發(fā)成天然抗氧化劑既營養(yǎng)又安全。為了能夠延長食品的保質(zhì)期，防腐劑的使用是不可或缺的，利用檸檬苦素及其類似物的抗菌活性，可以將其作為一種天然的防腐劑運(yùn)用在食品工業(yè)中。

3.2 醫(yī)藥中的應(yīng)用

檸檬苦素能夠通過保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，預(yù)防因衰老而產(chǎn)生的機(jī)體氧化損傷，來改善神經(jīng)退行性病變及認(rèn)知功能的下降，可以開發(fā)防衰老、提高學(xué)習(xí)記憶能力的植物源性藥物；檸檬苦素能通過抗炎、抗氧化來保護(hù)肝臟損傷，因此可用于研制治療肝臟疾病的天然藥物。通過體外實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了檸檬苦素類化合物具有防癌抑癌的生物活性，這將為開發(fā)食物來源的新型高效低毒的抗癌藥物奠定了基礎(chǔ)。此外，檸檬苦素具有防治骨質(zhì)疏松癥的生物活性，借此可以開發(fā)相關(guān)的藥品用來預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥。

3.3 在畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用

檸檬苦素類化合物在畜牧業(yè)中起著驅(qū)蟲保健、疾病防治、增強(qiáng)動物解毒能力、抗應(yīng)激、飼料保藏劑以及瘤胃調(diào)控作用。檸檬苦素及其類似物具有的多種優(yōu)良生物活性更加有利于動物健康，還可以將其開發(fā)成飼料添加劑添加到家獸家禽飼料中。這將有利于資源的有效綜合利用，減少環(huán)境污染，提高畜產(chǎn)品品質(zhì)。由于檸檬苦素及其類似物還具有昆蟲拒食和殺蟲的作用，可將其開發(fā)成一種新型綠色殺蟲劑和農(nóng)藥，這不僅可以用于防治多種農(nóng)作物害蟲，還可以防治不同植物病原菌的侵害。既能減少對環(huán)境的污染，又可以減少有毒殺蟲劑或農(nóng)藥對人類和動物的傷害。

4 展望

檸檬苦素及類似物具有抗癌、抗病毒、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛消炎和抗氧化等生物活性，基于此，可以將其開發(fā)成功能性產(chǎn)品進(jìn)行應(yīng)用，這將會給人類帶來較大的利益。但是有關(guān)檸檬苦素類化合物生物活性的相關(guān)機(jī)制，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性之間的聯(lián)系，不同功能基團(tuán)相對應(yīng)的作用等方面的研究還不夠深入，給開發(fā)利用帶來不便，因此還需要進(jìn)一步的研究。比如，檸檬苦素類化合物可以作為潛在的抗癌劑，它的機(jī)理主要是從通過信號傳遞通路的調(diào)控、線粒體途徑機(jī)制、凋亡基因表達(dá)等多條誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的途徑來進(jìn)行探討。但是，這些誘導(dǎo)途徑相互滲透、相互影響，因此需要更為深入地研究復(fù)雜的抗腫瘤機(jī)制。此外，檸檬苦素類化合物的抗氧化性和抑菌性與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系及作用機(jī)理目前尚不清楚，需進(jìn)一步研究。如果能夠合理高效地利用檸檬苦素類化合物，將會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。但是，檸檬苦素類化合物的生產(chǎn)還沒有進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；鋺?yīng)用還沒有商業(yè)化。因此，需要加強(qiáng)檸檬苦素類化合物在食品、醫(yī)藥、畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中的開發(fā)應(yīng)用，發(fā)揮其應(yīng)有的價(jià)值來造福全人類。

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