鯉春病毒血癥病毒SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法的建立

安 偉，肖 雨，張明輝，高曉華，何正侃

(上海市水產(chǎn)研究所 上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，上海 200433)

鯉春病毒血癥(Spring viraemia of carp,SVC)病原為SVC 病毒(SVCV)，是一種存在于鯉科魚類的高傳染性病毒性疾病，嚴(yán)重危害了鯉科魚類相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)已將SVC 列為必報(bào)的重要疾病之一，2008 年《中華人民共和國進(jìn)境動(dòng)物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》將其認(rèn)定為一類動(dòng)物疫病。

SVCV 由Fijian 等首次分離出來[2]，屬于彈狀病毒科，水泡口炎病毒屬；其病毒基因組為單股負(fù)鏈線性RNA，基因組RNA 為11 019 nt；病毒粒子呈典型子彈狀，長(zhǎng)80 nm～180 nm，寬60 nm～90 nm[3]。1998 年，英國從北京進(jìn)口的錦鯉中檢測(cè)出SVCV[4]，給我國水產(chǎn)品出口造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)中的SVC 的監(jiān)測(cè)工作尤為重要，近年來SVCV 的檢測(cè)技術(shù)也成為研究熱點(diǎn)。本研究針對(duì)SVCV N 基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，建立了SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 檢測(cè)方法，為SVCV的防制提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 病毒株 SVCV 由深圳出入境檢疫局動(dòng)植物實(shí)驗(yàn)室提供；草魚呼腸孤病毒(GCRV)由長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所提供；傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)由上海海洋大學(xué)提供；對(duì)蝦白班綜合征病毒(WSSV)和傳染性皮下及組織壞死病毒(IHHNV)由黃海水產(chǎn)研究所提供。

1.2 主要試劑 Ex Taq DNA 聚合酶、PCR 反應(yīng)試劑、SYBR GreenI 試劑盒、pMD18-T 載體、RNA/DNA 提取試劑盒及PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 均購自TaKaRa 公司；PCR 產(chǎn)物回收以及質(zhì)粒抽提試劑盒購自Axygen 公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank 中SVCV基因組中N 蛋白編碼基因的序列(AAK60421)，應(yīng)用PrimerExpress 軟件設(shè)計(jì)引物：5'-TCTGCCAAATCA CCATACTCA-3'/5'-CTGTCTTGCGTTCAGTGCTC-3'，預(yù)期擴(kuò)增目的片段為135 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 按照RNAiso 說明書提取SVCV 懸液中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA 為模板，擴(kuò)增目的基因。PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收克隆于pMD18-T 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。陽性重組質(zhì)粒命名為pMD-N，測(cè)定其濃度，并按照公式：拷貝數(shù)(拷貝/μL)=6.02×1023×質(zhì)粒濃度(g/μL)/質(zhì)粒分子量(g/mol)計(jì)算其拷貝數(shù)。將其按10 倍梯度稀釋，作為重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5 熒光定量RT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將pMD-N 標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋6 個(gè)濃度梯度(1.3×102拷貝/μL～1.3×108拷貝/μL)，參照SYBR Primix Ex Taq 試劑盒20 μL 體系，對(duì)引物濃度以及從退火溫度(56 ℃～66 ℃)進(jìn)行篩選。選用最佳優(yōu)化條件進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 特異性試驗(yàn) 以SVCV、GCRV、ISKNV、WSSV 和IHHNV 的cDNA 或DNA 為模板，利用建立的熒光定量RT-PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。

1.7 敏感性試驗(yàn) 將含有SVCV 的細(xì)胞病毒培養(yǎng)液(104.76TCID50/mL)進(jìn)行10 倍梯度稀釋6 個(gè)梯度，各取100 μL，采用病毒核酸提取試劑盒提取RNA，cDNA 合成后按照優(yōu)化的條件進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)RT-PCR 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，比較其靈敏度。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 將pMD-N 標(biāo)準(zhǔn)品分為3 個(gè)不同的濃度和批次，進(jìn)行批內(nèi)和批間的試驗(yàn)測(cè)定，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。計(jì)算其批內(nèi)和批間的變異系數(shù)。

1.9 臨床樣品檢測(cè) 采用建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)從養(yǎng)殖場(chǎng)采集的24 份樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與常規(guī)RT-PCR 方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以SVCV 提取的RNA 制備的cDNA 為模板，通過引物擴(kuò)增N 基因DNA 片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-N。經(jīng)PCR 擴(kuò)增鑒定，目的片段為135 bp，與預(yù)期的目的片段一致(圖1)。測(cè)序后的比對(duì)結(jié)果與GenBank 中SVCV N 基因序列(AAK60421)相符，表明N 基因片段正確克隆于pMD18-T 載體中。測(cè)得重組質(zhì)粒濃度為45.95 ng/μL，換算為拷貝數(shù)為1.3×1010拷貝/μL。

圖1 重組質(zhì)粒的鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid

2.2 熒光定量RT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的建立 經(jīng)優(yōu)化熒光定量RT-PCR 最佳反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，熒光染料(50×)0.4 μL，Rox 為0.4 μL，模板1 μL，滅菌水7.3 μL。最佳反應(yīng)程序：95 ℃30 s；95 ℃5 s，62 ℃40 s，40 個(gè)循環(huán)。

以10 倍倍比稀釋重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-N 為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，由7500 Software v2.0軟件自動(dòng)得到相應(yīng)的溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，溶解曲線表現(xiàn)為峰值單一，溶解溫度Tm 為85.8 ℃～86 ℃。標(biāo)準(zhǔn)曲線中Ct 值與重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品呈良好的線性關(guān)系，曲線方程為y=-3.207x+32.2733。R2=0.99，E=105.044 %。

圖2 熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線及溶解曲線Fig.2 The standard and melting curve of real-time RT-PCR

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果 采用建立的熒光定量RTPCR 方法對(duì)不同的病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，僅SVCV 核酸有擴(kuò)增曲線，即為陽性樣品。而GCRV、ISKNV、WSSV、IHHNV 和空白對(duì)照均為陰性，表明該方法特異性良好。

圖3 熒光定量RT-PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specificity test of the real-time RT-PCR for SVCV

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)SVCV 的6 個(gè)稀釋度樣品所提取得病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，熒光定量RT-PCR 檢測(cè)方法在104.76TCID50/mL～100.76TCID50/mL 5 個(gè)濃度的樣品中有效擴(kuò)增，10-0.76TCID50/mL 和空白對(duì)照為無效擴(kuò)增，而常規(guī)PCR 在102.76TCID50/mL 樣品中僅顯示弱陽性，表明熒光定量RT-PCR 比常規(guī)RT-PCR 方法敏感100 倍(圖4)。

圖4 熒光定量RT-PCR 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Sensitivity of real-time RT-PCR(A)and conventional RT-PCR(B)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)1.3×105，1.3×107以及1.3×108拷貝/μL 3 個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果數(shù)據(jù)經(jīng)相關(guān)軟件分析顯示，批內(nèi)Ct 變異系數(shù)小于4.2 %，批間變異系數(shù)小于7.6 %(表1)，表明重復(fù)性良好。

表1 熒光定量RT-PCR 檢測(cè)SVCV 批內(nèi)及批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Intra-and inter-batch reproducibility of real-time RT-PCR assay for SVCV

2.6 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果 采用建立的熒光定量RT-PCR 檢測(cè)方法對(duì)從養(yǎng)殖場(chǎng)采集的24 份樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與常規(guī)RT-PCR 方法比較。結(jié)果顯示，熒光定量RT-PCR 和常規(guī)RT-PCR 均檢出4 份陽性樣品，二者符合率為100%。表明本實(shí)驗(yàn)建立的方法可以用于SVCV 臨床檢測(cè)。

3 討論

目前對(duì)SVCV 的檢測(cè)有細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒、酶聯(lián)免疫法、免疫熒光、中和試驗(yàn)RT-PCR 等方法[5-6]，但這些方法無法在短時(shí)間內(nèi)精準(zhǔn)的檢測(cè)出低感染量的病毒粒子的樣本。而熒光定量RT-PCR 具有全封閉的反應(yīng)，自動(dòng)化程度高，無需電泳，不使用EB等優(yōu)點(diǎn)。從核酸提取到檢測(cè)完成只需2 h～3 h，并且同批反應(yīng)最多可對(duì)96 個(gè)樣品檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)效率，非常適合在短時(shí)間內(nèi)完成大量樣品的病原檢測(cè)及檢疫任務(wù)。該方法采用染料SYBR Green I 具有高靈敏性和特異性，降低了實(shí)驗(yàn)成本[7-8]。

SVCV 主要有5 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，其中針對(duì)G 蛋白的研究報(bào)道比較多，而有研究顯示G 蛋白在不同病毒株間基因序列存在一定差異，采用G 蛋白的檢測(cè)方法可能存在漏檢現(xiàn)象[9]。而N 蛋白為SVCV 中比例最高的蛋白，在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中發(fā)揮重要的作用，而且具有高度的保守性，因此本研究選擇N蛋白保守序列建立了SYBR Green I 熒光定量RTPCR 檢測(cè)方法。通過優(yōu)化整個(gè)反應(yīng)體系各項(xiàng)條件，重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的各個(gè)濃度模板(1.3×102拷貝/μL～1.3×106拷貝/μL)的熒光定量RT-PCR 的反應(yīng)均出現(xiàn)“S”型動(dòng)力學(xué)曲線，滿足熒光定量RT-PCR 擴(kuò)增的指數(shù)增長(zhǎng)，線性增長(zhǎng)以及平臺(tái)期3 個(gè)階段，并且各個(gè)梯度間指數(shù)增長(zhǎng)期平行，反應(yīng)各濃度的擴(kuò)增效率相近，符合熒光定量RT-PCR 的拷貝數(shù)與Ct 值得線性關(guān)系，直線回歸相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99，并且溶解曲線峰窄而單一。經(jīng)試驗(yàn)該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性良好，適用于大批量的病原樣品的檢測(cè)。

本研究建立的檢測(cè)SVCV 的熒光定量RT-PCR方法不僅可以對(duì)SVCV 進(jìn)行早期監(jiān)測(cè)，而且有利于分析病態(tài)下SVCV 的動(dòng)態(tài)變化，為SVCV 的感染機(jī)制研究提供重要參考。

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