基于nad5 基因分析黑斑蛙裂頭蚴種系發(fā)育關(guān)系

李 暉，王先坤，鄧興珍，劉譚彬，譚 磊，劉 偉*

(1.湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.沅陵縣畜牧水產(chǎn)局，湖南 懷化 419600)

裂頭蚴(Sparganum)屬于假葉目，雙葉槽科，裂頭屬。并且是絳蟲的幼蟲階段。裂頭蚴的感染地區(qū)主要以亞洲南部為主，特別是在一些發(fā)展中國家感染尤為突出。裂頭蚴主要以感染犬、貓為主，也能感染人，是一種人畜共患的寄生蟲病。裂頭蚴在宿主中的寄生部位因宿主不同而存在差異，例如：在豬、蛇、蛙等宿主主要是寄生在皮下、粘膜和肌肉，偶見于豬的膽管內(nèi)。而在貓、犬、人等宿主則以寄生在小腸內(nèi)為主[1-4]。

隨著時間的推移，很多寄生蟲在形態(tài)學(xué)上發(fā)生了改變，所以傳統(tǒng)的鑒定方法已經(jīng)不能有效的進(jìn)行分類。而此時，分子標(biāo)記已經(jīng)在寄生蟲學(xué)的分類學(xué)中被廣泛應(yīng)用。近年來，線粒體DNA(mtDNA)作為一種核外遺傳物質(zhì)，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快、母性遺傳、無組織特異性等特點(diǎn)，使之成為研究寄生蟲系統(tǒng)進(jìn)化的一種理想的分子標(biāo)記[5-6]。利用PCR 方法并結(jié)合DNA 序列分析，首次系統(tǒng)地對蛙裂頭蚴線粒體利用線粒體nad5 基因的序列進(jìn)行多態(tài)性研究，并利用nad5重構(gòu)裂頭蚴與其他絳蟲蚴的種群遺傳關(guān)系，從而明確裂頭蚴線粒體nad5 基因序列能否成為理想的種間遺傳標(biāo)記，從而為裂頭蚴的種群體遺傳學(xué)研究和其相關(guān)疾病的診斷奠定了基礎(chǔ)[7-10]。

1 材料和方法

1.1 蟲體樣品 9 個黑斑蛙裂頭蚴樣品采自湖南張家界(SeZJJ)、湖南星沙(SeXS)、湖南衡陽(SeHY)、湖南株洲縣(SeZZX)、湖南望城(SeWC)、湖南邵陽(SeSY)、湖南瀏陽(SeLY)、湖南長沙(SeCS)、湖南醴陵(SeLL)，分別保存于70 %酒精中。

1.2 主要試劑 Taq DNA 聚合酶及相關(guān)試劑購自TaKaRa 公司；蛋白酶K 購自Merck 公司；WizardTMDNA Clean-up System 試劑盒和基因組DNA 提取試劑盒(Wizard SV GenomicDNA Purification System)購自Promega 公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 目的DNA 片段擴(kuò)增 利用DNA 提取試劑盒提取裂頭蚴基因組DNA，以其為模板，按照文獻(xiàn)[11]設(shè)計合成一對引物(5'-TCATACTGGGTCTATCA GGTGTT-3'/5'-ACAGCAAAGTTAGGGGGTAATAGG T-3')，進(jìn)行nad5 基因片段的PCR 擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段為510 bp。反應(yīng)體系為50 μL，擴(kuò)增條件為：94 ℃5 min；94 ℃30 s、51 ℃30 s、72 ℃30 s，共38 個循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 nad5 基因片段序列測定和序列分析 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，9 個樣品的測序結(jié)果采用DNAStar 5.0 軟件進(jìn)行分析，并與GenBank 中登錄的代表性的裂頭蚴nad5序列進(jìn)行比較，以胎生網(wǎng)尾線蟲(D.viviparus)作為外群。利用Clustal X2.0 及Mega 4.1 軟件對擴(kuò)增的nad5 序列進(jìn)行比對，并利用Mega 4.1 程序中的臨接法(Neighbor-joining method，NJ)構(gòu)建種系發(fā)育樹。NJ 法在軟件默認(rèn)設(shè)置下進(jìn)行分析；同時利用DNAStar 5.0 中的Megalign 程序進(jìn)行相似性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 目的DNA 片段的擴(kuò)增結(jié)果 9 個黑斑蛙裂頭蚴樣品均擴(kuò)增出約510 bp nad5，與預(yù)期目的片段長度相符，并且無非特異性片段，空白對照為陰性(圖1)。

圖1 裂頭蚴線粒體p nad5 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of mtDNA nad5 gene fragment from frog sparganum by PCR

2.2 測序與序列分析結(jié)果 測序結(jié)果顯示，擴(kuò)增的蛙裂頭蚴nad5 片段大小為510 bp，對9 條黑斑蛙裂頭蚴nad5序列進(jìn)行了種內(nèi)比較，結(jié)果顯示，9 個不同個體間的nad5序列的差異為0～3 %，分離株之間的nad5序列相差21 bp，其差異主要是以堿基替換為主。湖南省各分離株之間相應(yīng)序列的相似性在97 %以上，湖南分離株與基因庫中其它裂頭蚴nad5序列的相似度均低于89 %。

2.3 nad5 基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建 通過種系發(fā)育分析顯示，利用NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果顯示，湖南9 株分離株中，有5 株(SeCS、SeLL、SeHY、SeZJJ 和SeZZX)位于同一分支，并且同源性為100 %。而其余4 株湖南分離株(SeSY、SeLY、SeXS 和SeWC)與闊節(jié)裂頭絳蟲(D.latum)位于另一分支，這4 株湖南分離株同源性為96 %，而與闊節(jié)裂頭絳蟲的同源性為89 %(圖2)。系統(tǒng)發(fā)生樹中的Bootstrap 值較高。湖南省各分離株之間相隔較近，但與其他絳蟲所屬分支相隔較遠(yuǎn)，具有鑒別意義。

圖2 基于nad5 基因序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 The Bootstrap consensus phylogram of the stationary tree reconstructed by NJ based on the nad5 sequences

本研究結(jié)果表明，蛙裂頭蚴湖南省分離株序列與基因庫中的D.latum 的序列均有相當(dāng)高的相似性(p nad5 為96.4 %)，9 個蛙裂頭蚴湖南省分離株與基因庫中其它絳蟲序列相比，相似性較低nad5 為89 %。采用NJ 法構(gòu)建的進(jìn)化樹與其具有一致性，顯示出湖南省分離株與D.latum 位于同一大分支，9個分離株所屬分支與其他絳蟲所屬分支相隔較遠(yuǎn)。本研究結(jié)果表明，蛙裂頭蚴湖南省分離株nad5 序列的種內(nèi)相對保守，種間差異相對較大，說明nad5 序列能夠作為蛙裂頭蚴的遺傳分子標(biāo)記用于蛙裂頭蚴的分類學(xué)和鑒別鑒定研究。本研究結(jié)果填補(bǔ)了國內(nèi)關(guān)于蛙裂頭蚴nad5 序列研究的空白，為蛙裂頭蚴的分類鑒定以及進(jìn)一步的分子流行病學(xué)調(diào)查和群體遺傳研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]Zhu Xing-quan,Gasser R B,Chilton N B,et al.Molecular approaches for studying as caridoid nematodes with zoonotic potential,with an emphasis on Toxocara Species[J].J Helminthol,2001,75(2):101-108.

[2]Zhu Xing-quan,Chilton N B,Jacobs D E,et al.Characterisation of Ascaris from human and pig hosts by nuclear ribosomal DNA sequences[J].Int J Parasitol,1999,29(3):469-478.

[3]郭凱文，牛安歐.線粒體基因組及其在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)寄生蟲病分冊，2002，29(4)：149-153.

[4]Liu Wen-jiang,Zhao Guang-hui,Tan M Y,et al.Survey of Spirometra erinaceieuropaei spargana infection in the frog Rana nigromaculata of the Hunan province of China[J].Vet Parasitol,2010,173:152-156.

[5]Gasser R B,Rossi L,Zhu Xing-quan.Identification of Nematodirus species(Nematoda:Molineidae)from wild ruminants in Italy using ribosomal DNA Markers[J].Int J Parasitol,1999,29(11):1809-1817.

[6]Li Ming-wei,Lin Rui-qing,Song Hui-qun,et al.Electrophoretic analysis of sequence variability in three mitochondrial DNA regions for ascaridoid parasites of human and animal health significance[J].Electrophoresis,2008,29(13):2912-2917.

[7]Ooi H K,Chang S L,Huang C C,et al.Survey of Spirometra erinaceieuropaei in frogs in Taiwan and its experimental infection in cats[J].J Helminthol,2000,74(02):173-176.

[8]Pampiglione S,Fioravanti M L,Rivasi F.Human sparganosis in Italy.Case report and review of the European cases[J].APMIS,2003,111(2):349-354.

[9]Tamura K,Dudley J,Nei M,Kumar S.MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0[J].Mol Biol Evol,2007,24(8):1596-1599.

[10]Zhao Guang-hui,Mo X H,Zou F C,et al.Genetic variability among Schistosoma japonicum isolates from different endemic regions in China revealed by sequences of three mitochondrial DNA genes[J].Vet Parasitol,2009,162(1-2):67-74.

[11]劉自逵，趙光輝，劉國華，等.湖南省猬迭宮絳蟲的線粒體nad5 和rrns 基因的序列測定及種系發(fā)育分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2012，32(2)：258-261.