ISG15 蛋白促進(jìn)豬源牛病毒性腹瀉病毒2 型對I 型IFN 表達(dá)抑制的研究

陶 潔，廖金虎，張 倩，張信軍，朱國強(qiáng)

(1.揚州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；3.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106)

豬源牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)的流行日益廣泛，在國內(nèi)外豬群中的感染現(xiàn)狀已相當(dāng)嚴(yán)重，成為一個不容忽視的問題[1]。通常，豬感染BVDV 不表現(xiàn)出臨床癥狀，或表現(xiàn)出類似于豬瘟癥狀，因此豬BVDV 感染和CSFV 感染常被混淆[2]。這不僅給豬瘟檢疫帶來了困難，也給BVDV 防控添加了新的難題。BVDV 感染動物可以引起免疫抑制，以此逃避宿主先天免疫功能，并在宿主機(jī)體中呈持續(xù)性感染[3]。研究證實，只有非致細(xì)胞病變(NCP)型BVDV 實驗性感染動物才能誘發(fā)持續(xù)性感染[4]。目前，關(guān)于BVDV 逃避機(jī)體先天免疫的機(jī)制尚不清楚，而了解這一機(jī)制有助于制定更全面的防控措施，從而更好的預(yù)防和控制BVDV 在豬群和牛群中的感染。

泛素樣蛋白ISG15 是干擾素α/β(IFN-α/β)信號的一個負(fù)調(diào)控因子，該蛋白可以抑制多種DNA 病毒和RNA 病毒的增殖，屬于宿主的天然免疫蛋白[5]。因此，闡明ISG15 和豬源BVDV-2 之間的相互作用，不僅可以更清楚的了解ISG15 抗病毒機(jī)制，也可以為深入研究豬源BVDV-2 逃避細(xì)胞先天免疫作用的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細(xì)胞、多抗及質(zhì)粒 豬源BVDV-2 SH-28 株由本實驗室分離鑒定；牛腎細(xì)胞系(MDBK)和質(zhì)粒pEC129[6]由美國賓夕法尼亞大學(xué)Dr.Leonard教授贈予；鼠抗ISG15 多克隆抗體由本實驗室制備；E.coli DH5α 由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、r Taq DNA 聚合酶、DL2000 Marker 均購自TaKaRa公司；Donor Equine Serum(HS)購自Hyclone(Thermo scientific)；G418 Sulfate 購自Sigma-Aldrich 公司；TRIzol Reagent、Lipofectamine LTX and PlusTMReagent、SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR購自Invitrogen 公司；FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)購自Roche 公司；poly I:C 購自Sigma公司。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank 中登錄的牛IFN 刺激因子ISG15 基因序列(AF069133)設(shè)計一對引物，并在上下游引物末端分別引入NheⅠ和Bam HⅠ酶切位點。引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成(表1)。

內(nèi)參基因GAPDH、IFN-α、IFN-β 和ISG15 基因熒光定量PCR 引物由上海Invitrogen 公司設(shè)計并合成(表1)。

表1 各基因的PCR 引物Table 1 PCR primers for amplification of the genes

1.4 ISG15 基因的擴(kuò)增及重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以人源IFN-α-2A 刺激MDBK 細(xì)胞后[7]，提取細(xì)胞總RNA 并反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，采用引物ISG15-1/2 PCR 擴(kuò)增ISG15 基因。以NheⅠ和Bam HⅠ雙酶切后克隆于真核表達(dá)載體pEC129 中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEC-ISG15，并進(jìn)行測序鑒定。

1.5 穩(wěn)定表達(dá)ISG15 蛋白細(xì)胞系的構(gòu)建與篩選將G418 設(shè)定10 個濃度梯度，以100 μg/mL 為遞增值，分別為100 μg/mL～1 000 μg/mL，每組設(shè)3 個平行樣。連續(xù)培養(yǎng)10 d～14 d，待MDBK 細(xì)胞全部死亡時G418 的最低濃度為MDBK 細(xì)胞最佳篩選濃度[8]。篩選穩(wěn)定細(xì)胞系時使用的濃度比最佳篩選濃度高一個稀釋度，維持液濃度為最佳篩選濃度的一半。

參照Lipofectamine LTX and PlusTMReagent 說明書，將pEC129-ISG15 轉(zhuǎn)染MDBK 細(xì)胞；培養(yǎng)6 h后，將細(xì)胞上清液換成含有10 % HS 的DMEM 完全培養(yǎng)液。同時設(shè)置空質(zhì)粒對照。參照文獻(xiàn)[9]方法，將轉(zhuǎn)染24 h 后的MDBK 細(xì)胞傳代至新的6 孔細(xì)胞板中(約2×104個/孔)。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液更換為含最佳工作濃度G418 的完全培養(yǎng)液進(jìn)行抗性篩選；每2 d～3 d 更換一次培養(yǎng)基，直至陰性對照組中細(xì)胞全部死亡；將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞孔內(nèi)篩選培養(yǎng)基更換為維持培養(yǎng)基，即調(diào)整G418 終濃度為300 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，直至6 孔板中長出單克隆細(xì)胞團(tuán)；將其進(jìn)行胰酶消化傳代，以含300 μg/mL G418 培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，并逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)，形成穩(wěn)定的傳代細(xì)胞系，將其命名為E53。

1.6 穩(wěn)定表達(dá)ISG15 蛋白細(xì)胞系的鑒定

1.6.1 間接免疫熒光(IFA)鑒定 將第10 代建立的細(xì)胞系E53 鋪于24 孔培養(yǎng)板，以鼠抗ISG15 多克隆血清(1∶2 500)為一抗，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)為二抗進(jìn)行ISG15 蛋白表達(dá)的IFA 鑒定[10]。

1.6.2 Western blot 鑒定 將第10 代建立的細(xì)胞系E53 細(xì)胞裂解后，進(jìn)行收集細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜后以鼠抗ISG15 多克隆抗體(1∶2 500)為一抗，HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)為二抗，進(jìn)行ISG15 蛋白表達(dá)的western blot 鑒定。

1.7 病毒增長曲線的繪制 將病毒(1 MOI)分別感染單層MDBK 細(xì)胞和E53 細(xì)胞。在感染后不同時間點分別收集細(xì)胞上清液，并分別測定其TCID50，繪制病毒在兩種細(xì)胞中的病毒滴度增長曲線。

1.8 I 型IFN 的熒光定量PCR 檢測 棄去細(xì)胞上清，加入1 mL 細(xì)胞裂解液，4 ℃作用30 min，收集單層細(xì)胞，12 000 r/min 離心10 min；吸取400 μL上清液，參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 說明書，提取細(xì)胞總RNA 并反轉(zhuǎn)錄。將cDNA 稀釋3 倍后作為模板，按FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)說明書，采用SYBR Green I 法進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，以GAPDH 基因為內(nèi)參，檢測各樣品中I 型IFN 的相對表達(dá)量。同時設(shè)陰性對照，檢測數(shù)據(jù)利用2-△△CT方法進(jìn)行處理[11]。采用SPASS13.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

1.9 ISG15 對病毒誘導(dǎo)I 型IFN 表達(dá)影響的檢測取等量的E53 細(xì)胞和MDBK 細(xì)胞分別鋪于6 孔細(xì)胞板中，24 h 后各孔內(nèi)加入終濃度為50 μg/mL 的poly I:C；作用6 h 后，各孔加入1 MOI BVDV-2；吸附1 h 后，棄去細(xì)胞上清，分別加入DMEM 維持液繼續(xù)培養(yǎng)；24 h 后，收集細(xì)胞，利用熒光定量PCR 檢測細(xì)胞內(nèi)IFN-α 和IFN-β 的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 ISG15 基因的擴(kuò)增及重組真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定利用ISG15-1/2 引物PCR 擴(kuò)增ISG15 基因，結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段約為500 bp，與預(yù)期相符(圖1)。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后克隆至真核表達(dá)載體pEC129 中，經(jīng)鑒定，重組質(zhì)粒pEC-ISG15 構(gòu)建正確。

圖1 ISG15 的PCR 擴(kuò)增Fig.1 Amplification of ISG15 gene by PCR

2.2 穩(wěn)定表達(dá)ISG15 蛋白細(xì)胞系的鑒定 經(jīng)篩選，MDBK 細(xì)胞的最佳篩選濃度為600 μg/mL G418，獲得單克隆細(xì)胞團(tuán)后，即利用300 μg/mL G418 的維持液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

以ISG15 多克隆抗體為一抗，對第10 代穩(wěn)定細(xì)胞系E53 進(jìn)行IFA 和western blot 檢測，同時設(shè)MDBK 細(xì)胞作為陰性對照。結(jié)果顯示，穩(wěn)定細(xì)胞系E53能夠穩(wěn)定表達(dá)ISG15 蛋白(圖2)。

圖2 過表達(dá)ISG15 細(xì)胞系E53 的IFA(A)和western blot(B)的鑒定Fig.2 Idetification of the ISG15 over-expressed cell line E53 by IFA(A)and western blot(B)

2.3 ISG15 蛋白對BVDV-2 復(fù)制的影響 將BVDV-2以1 MOI 的劑量分別感染E53 和MDBK 細(xì)胞，于不同時間點分別測定其病毒滴度，并繪制病毒增長曲線。結(jié)果表明，病毒在MDBK 細(xì)胞中滴度呈逐漸遞增趨勢，60 h 時病毒滴度達(dá)到峰值(TCID50為10-6.5)；在E53 細(xì)胞中，病毒滴度雖有所增長，但變化趨勢不大，60 h 時TCID50為10-3.8(圖3)。兩者差異顯著(p<0.05)，表明過表達(dá)ISG15 蛋白對BVDV-2的復(fù)制具有明顯抑制作用。

圖3 ISG15 蛋白對豬源BVDV-2 復(fù)制的影響Fig.3 The effect of ISG15 protein on the replication of BVDV-2

2.4 BVDV-2 感染對ISG15 基因表達(dá)的影響 將BVDV-2 以1 MOI 的劑量感染E53 細(xì)胞同時設(shè)未感染的E53 細(xì)胞空白對照；分別在不同時間點收集細(xì)胞并提取其總RNA，利用熒光定量PCR 檢測各時間點細(xì)胞內(nèi)ISG15 基因表達(dá)情況；結(jié)果顯示，與空白對照相比，病毒感染的E53 細(xì)胞中ISG15 基因表達(dá)量明顯高于空白對照E53 細(xì)胞，48 h 時ISG15 基因的表達(dá)差異顯著(p<0.05)，表明BVDV-2 感染細(xì)胞后能夠促進(jìn)ISG15 的表達(dá)(圖4)。

圖4 豬源BVDV-2 感染細(xì)胞對ISG15 基因表達(dá)的影響Fig.4 The effect of pig BVDV-2 infection on the relative mRNA transcription levels of ISG15 gene

2.5 ISG15 基因?qū)VDV-2 誘導(dǎo)I 型IFN 表達(dá)的影響 病毒感染MDBK 和E53 細(xì)胞，結(jié)果表明均能夠抑制由poly I:C 誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-α 和IFN-β。MDBK細(xì)胞中，IFN-α 和IFN-β 表達(dá)量分別下降約2.49 和3.31 倍；而E53 細(xì)胞中，IFN-α 和IFN-β 分別下降約6.29 倍和9.71 倍，表明ISG15 蛋白的存在能夠提高BVDV-2 抑制I 型IFN 表達(dá)的能力(圖5)。

圖5 ISG15 促進(jìn)BVDV-2 抑制I 型IFN 表達(dá)Fig.5 The role of ISG15 on BVDV-2 inhibited IFN-I

3 討論

研究報道，ISG15 在宿主天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，它能夠抑制多種病毒的復(fù)制，從而發(fā)揮抗病毒功能[12]。因此，研究ISG15 蛋白和豬源BVDV-2 之間相互作用關(guān)系，不僅有助于了解ISG15 的抗病毒機(jī)制，也為豬源BVDV-2 逃避細(xì)胞先天免疫機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，從而為BVDV 持續(xù)性感染機(jī)制的研究提供依據(jù)，有助于制定更全面的BVDV 防控措施及BVDV 新型疫苗的研制。

SH-28 株是由本實驗室分離鑒定的一株NCP 型豬源BVDV-2 分離株，以此為基點，結(jié)合以前所做的基礎(chǔ)工作，本實驗展開豬源BVDV-2 和ISG15 相互作用研究。結(jié)果顯示BVDV-2 SH-28 株在E53 細(xì)胞系中增殖速度明顯下降，表明過量表達(dá)ISG15 能夠抑制豬源BVDV-2 復(fù)制。此外，感染BVDV-2 可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ISG15 的表達(dá)，這可能是由于BVDV-2感染細(xì)胞，激活了細(xì)胞的先天免疫，使ISG15 表達(dá)量升高，從而發(fā)揮其抗病毒功能。此外，我們還研究了ISG15 蛋白對豬源BVDV-2 抑制I 型IFN 表達(dá)的影響，將SH-28 株分別感染經(jīng)poly I:C 處理的MDBK 細(xì)胞和E53 細(xì)胞，利用熒光定量PCR 檢測不同細(xì)胞內(nèi)I 型IFN 的表達(dá)情況，結(jié)果表明經(jīng)SH-28株感染后，E53 細(xì)胞內(nèi)I 型IFN 表達(dá)下降的倍數(shù)高于MDBK 細(xì)胞內(nèi)I 型IFN 下降的倍數(shù)，表明ISG15能夠促進(jìn)豬源BVDV-2 抑制I 型IFN 的表達(dá)，為探索BVDV-2 的免疫抑制機(jī)制提供了線索。

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