基于重組外膜蛋白的豬流產(chǎn)嗜性衣原體病抗體ELISA 檢測(cè)方法的建立

周丹娜，楊克禮，閆少俠，劉澤文，段正贏，郭 銳，袁芳艷，劉 威，孟 麗，田永祥*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，湖北 武漢 430064；2.動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064)

衣原體是一類能夠引起人和多種動(dòng)物患病的專性細(xì)胞內(nèi)寄生的人畜共患病病原微生物，可引起結(jié)膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎、腸道疾病，以及孕婦和懷孕母畜流產(chǎn)、死胎，給人畜健康造成嚴(yán)重危害[1-2]。流產(chǎn)嗜性衣原體(Chlamydophila abortus)在1999 年以前一直被命名為鸚鵡熱衣原體血清型Ⅰ，而后Everett等根據(jù)16S rRNA 與23S rRNA 基因序列進(jìn)化分析以及MOMP 基因序列中限制性酶切位點(diǎn)的不同，從鸚鵡熱衣原體中分離出3 個(gè)新的衣原體種，即C.abortus、貓嗜性衣原體和豚鼠嗜性衣原[3]。目前，傳統(tǒng)的衣原體病檢測(cè)方法主要有細(xì)胞培養(yǎng)[4-5]、間接血凝試驗(yàn)(IHA)[6]以及競(jìng)爭(zhēng)ELISA 試驗(yàn)[7]等，而這些實(shí)驗(yàn)方法均存在不足。如細(xì)胞培養(yǎng)法操作繁瑣、周期長(zhǎng)等；間接血凝試驗(yàn)的敏感度低；PCR 檢測(cè)技術(shù)與ELISA檢測(cè)方法相比，雖然靈敏度以及特異性均較好，但對(duì)設(shè)備要求較高，并且存在污染，難以適應(yīng)基層工作的需要。因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)便、高效、廉價(jià)的C.abortus 抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)于科學(xué)研究和臨床檢測(cè)C.abortus 的流行狀況等均具有重要的意義。

本研究基于C.abortus MOMP 重組蛋白建立了檢測(cè)C.abortus 抗體的ELISA 方法，為該病的防制及流行病學(xué)調(diào)查提供一種可行方法。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 重組MOMP 蛋白(rMOMP)，C.abortus 參考陰、陽(yáng)性血清，豬流行性乙型腦炎病毒(JEV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)以及豬衣原體(C.abortus)陽(yáng)性血清均由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室保存或制備；衣原體IHA 試劑盒購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG(IgG-HPR)、小牛血清白蛋白組分V(BSA)購(gòu)自Sigma 公司；pH 7.4 PBS 緩沖液、pH9.6 的碳酸鹽緩沖液、含吐溫-20 終濃度0.5 ‰的pH7.4 PBST緩沖液、含BSA 1 %的pH7.4 PBS 自配、底物緩沖液A、底物緩沖液B 購(gòu)自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司；臨床血清樣品來自湖北省內(nèi)5 個(gè)不同地區(qū)的規(guī)?；i場(chǎng)。

1.2 間接ELISA 抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的選擇將本實(shí)驗(yàn)室制備并純化的rMOMP[8]用方陣法確定最佳的蛋白包被濃度和血清稀釋度，具體操作如下：將rMOMP 用包被液倍比稀釋包被8個(gè)濃度，第一行從1∶10 開始，100 μL/孔；4 ℃過夜，用PBST 緩沖液洗滌3 次，每次3 min；每孔加BSA 1%的pH7.4 PBS 緩沖液200 μL 進(jìn)行封閉，37 ℃溫育1 h，同上洗滌3 次；將參考陰、陽(yáng)性血清分別從1∶12.5 稀釋開始，橫向倍比稀釋，8 個(gè)濃度滴度，100 μL/孔，37 ℃溫育1 h；同上洗滌3 次；以羊抗豬IgG-HRP(1∶5 000)為二抗，100 μL/孔，37 ℃溫育1 h，同上洗滌3 次；加底物緩沖液A 和B，各1 滴，8 min 后加終止液，酶標(biāo)儀測(cè)OD630nm值，根據(jù)P/N 值確定酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度。

1.3 酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的選擇 應(yīng)用已確定的最適抗原包被濃度和血清最佳稀釋度來確定酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度，將羊抗豬IgG-HRP 按1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000 和1∶10 000 稀釋，根據(jù)P/N 值確定酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度。

1.4 臨界值的確定 選取衣原體檢測(cè)呈陰性的豬血清樣品35 份，按上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行ELISA 檢測(cè)，同時(shí)設(shè)參考陰、陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)最后的OD630nm值，計(jì)算35 份陰性血清的平均值(X)及標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，則陰陽(yáng)性臨界值為X+3SD。

1.5 間接ELISA 特異性試驗(yàn) 采用上述確定的反應(yīng)條件，同時(shí)檢測(cè)JEV、CSFV、PRV、PRRSV 以及C.abortus 陽(yáng)性血清，驗(yàn)證所建立的ELISA 方法的特異性。

1.6 間接ELISA 敏感性試驗(yàn) 將C.abortus 參考陽(yáng)性血清分別做1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 稀釋，按上述步驟進(jìn)行間接ELISA 試驗(yàn)，檢測(cè)該ELISA 方法的敏感性。

1.7 間接ELISA 重復(fù)性試驗(yàn) 采用3 塊不同批次的ELISA 板同時(shí)檢測(cè)6 份臨床血清樣品，每份血清做3 個(gè)重復(fù)，計(jì)算不同批次間的變異系數(shù)。

1.8 符合率試驗(yàn) 利用建立的ELISA 方法與IHA試驗(yàn)對(duì)來自湖北省5 個(gè)不同規(guī)模化豬場(chǎng)的62 份隨機(jī)血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較二者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 ELISA 反應(yīng)條件的確定 采用方陣滴定法確定rMOMP 的包被濃度和待檢血清稀釋度，并在該基礎(chǔ)上對(duì)各個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表1 所示。

2.2 陰陽(yáng)性臨界值的判定 根據(jù)35 份衣原體抗體陰性血清檢測(cè)結(jié)果的OD630nm(圖1)，計(jì)算其臨界值其中SD=0.053，臨界值=0.18+3×0.053=0.34，即 OD630nm≥0.34 者判為陽(yáng)性，OD630nm<0.34 者判為陰性。

表1 ELISA 檢測(cè)方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions of ELISA

圖1 陰性樣品結(jié)果正態(tài)分布圖Fig.1 Negative samples normal distribution diagram

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果 選擇臨床上引起豬流產(chǎn)的常見病原，如JEV、CSFV、PRV 以及PRRSV 的陽(yáng)性血清，按1:50 的最佳稀釋度進(jìn)行ELISA 檢測(cè)。結(jié)果顯示，該ELISA 方法只與C.abortus 陽(yáng)性血清反應(yīng)，OD630nm值為0.985(表2)，表明建立的ELISA 方法具有良好的特異性。

表2 特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of cross-reactivity test

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 將C.abortus 參考陽(yáng)性血清分別倍比稀釋進(jìn)行ELISA 試驗(yàn)，結(jié)果顯示，當(dāng)血清稀釋800 倍時(shí)，經(jīng)該ELISA 方法仍然可以檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果(圖2)，表明該方法具有良好的敏感性。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 采用3 塊不同批次的ELISA板同時(shí)檢測(cè)6 份臨床血清樣品，結(jié)果表明，不同批次的ELISA 板，其變異系數(shù)最大為6.70 %，最小為3.15 %，均小于10 %(表3)，表明不同批次包被板具有良好的重復(fù)性。

2.6 與IHA 試驗(yàn)方法的比較結(jié)果 利用本研究建立的ELISA 方法和IHA 方法對(duì)來自湖北省5 個(gè)不同規(guī)模化豬場(chǎng)的62 份隨機(jī)血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示ELISA 方法檢測(cè)的陽(yáng)性率83.87 %(52/62)，IHA檢測(cè)陽(yáng)性率為70.97 %(44/62)，兩種方法的總符合率為87.09 %(54/62)(表4)。

圖2 陰/陽(yáng)性血清敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Sensitivity assay of negtive and positive serum samples

表3 間接ELISA 3 批次診斷試劑重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果(n=6)Table 3 The repeatability test of indirect ELISA(n=6)

表4 兩種方法符合性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The result of the conformance test

3 討論

特異性檢測(cè)抗原的選擇是建立ELISA 抗體檢測(cè)方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，C.abortus 病血清學(xué)診斷抗原主要有MOMP 和POMP。MOMP 作為一種主要外膜蛋白，其表面存在多種抗原表位，包括屬、種、血清型等特異性表位。MOMP 屬特異性抗原表位可能是一種三級(jí)結(jié)構(gòu)抗原表位，而原核表達(dá)的rMOMP只能與同源的抗血清特異性結(jié)合[9]。因此，本研究選擇rMOMP 作為診斷抗原來建立C.abortus 病ELISA 抗體檢測(cè)方法。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示，MOMP 全長(zhǎng)蛋白的序列，前22 aa 為信號(hào)肽序列；第aa20～aa90 位氨基酸區(qū)域抗原性強(qiáng)，但不是表面抗原位點(diǎn)，而在100 位、240 位以及345 位氨基酸殘基位點(diǎn)的抗原性較強(qiáng)，并且均為表面抗原位點(diǎn)[8]。蛋白的外源表達(dá)系統(tǒng)中，信號(hào)肽對(duì)其產(chǎn)量、運(yùn)輸及產(chǎn)物的加工復(fù)性等有重要影響。Hoelzle 等對(duì)衣原體MOMP 原核表達(dá)的研究也證明，全長(zhǎng)表達(dá)不僅影響蛋白的表達(dá)量，而且對(duì)蛋白的活性也有很大的影響[10]。此外，結(jié)合對(duì)本株衣原體momp 基因限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析，該基因序列的271 bp 為Bam HⅠ，經(jīng)此酶切位點(diǎn)切割后基因讀碼框不受到影響。綜上，本研究從獲得較高活性的重組蛋白來提高以此蛋白建立的ELISA 方法的敏感性和特異性角度考慮，選擇其天然存在酶切位點(diǎn)的截短表達(dá)MOMP 蛋白為包被抗原建立ELISA 檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法與IHA方法的符合率可達(dá)87.09 %，高于用全長(zhǎng)rMOMP 構(gòu)建的ELISA 方法[11]。并且實(shí)驗(yàn)表明本研究建立的ELISA 方法具有良好的特異性，敏感性，以及重復(fù)性，適用于臨床及現(xiàn)地C.abortus 的檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA 方法為C.abortus 的檢測(cè)提供了一種可行方法，能夠用于該病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查，為該病的防制奠定基礎(chǔ)。

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