黑蜂王臺病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法的建立

王向輝，隋佳辰，張 健，鄭 言，楊 倩，宋戰(zhàn)昀，王振國,

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，吉林 長春 130062)

蜜蜂黑蜂王臺病毒(Black queen cell virus，BQCV)首次發(fā)現(xiàn)于死亡的蜂王幼蟲和蛹中，春季和初夏多發(fā)[1-2]，主要引起封蓋期蜂王幼蟲病害，并被證明是導(dǎo)致澳大利亞蜂王幼蟲死亡的最常見的病因[3]。目前針對BQCV 主要的檢測技術(shù)有：基于發(fā)病癥狀的檢測、免疫學(xué)檢測、顯微鏡檢測、針對核酸序列的檢測。前3 種方法由于蜜蜂發(fā)病癥狀復(fù)雜、病毒基因具有一定同源性、樣本處理復(fù)雜且費(fèi)用昂貴等缺陷，不被廣泛使用。而針對核酸序列的檢測技術(shù)中，RT-PCR 和熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)技術(shù)被廣泛應(yīng)用，但靈敏度不足和檢測耗時(shí)長對檢測過程產(chǎn)生一定的影響[4-5]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是在等溫條件下進(jìn)行，具有特異、快速、操作簡便等特點(diǎn)[6]。本研究針對BQCV VP 基因保守區(qū)設(shè)計(jì)LAMP 引物，通過加入SYBR Green I 熒光染料[7]，建立了可視化的檢測BQCV 的LAMP 方法，為BQCV 病原學(xué)快速檢測提供了技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 病毒株及樣品來源 BQCV-JL1 株、蜜蜂殘翼病毒(DWV)、蜜蜂囊狀幼蟲病毒(SBV)、蜜蜂慢性麻痹病毒(CBPV)、蜜蜂急性麻痹病毒(ABPV)均由技術(shù)中心動植檢實(shí)驗(yàn)室保存；被檢40 份臨床樣品采集于部分省份蜂場。

1.2 主要試劑與儀器 SYBR Green I 購自Invitrogen公司；RNA 轉(zhuǎn)錄純化試劑盒和PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 購自TaKaRa 公司；質(zhì)粒pGEM-T easy 和Riboprobe System-T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega 公司；Omega Biotek 質(zhì)粒小量提取試劑盒I 型購自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司；DNA LAMP Kit 及LA-320 型LAMP real-time Turbidimeter 儀購自日本榮源株式會社。

1.3 LAMP 引物設(shè)計(jì)與篩選 根據(jù)GenBank 登錄的BQCV-JL1 株序列(KP119603.1)，選取BQCV 衣殼蛋白VP 基因序列中保守區(qū)域，采用Primer Explorer V4 軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

1.4 BQCV 核酸的提取及重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建 按照TRIzol 法從病料中提取BQCV 總RNA，參照PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明書反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以其為模板，以F3/B3 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃1 min、55 ℃1 min；72 ℃1 min，循環(huán)30 次；72 ℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收后克隆至pMD18-T 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-BQCV，提取重組質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定，并測定其濃度。

表1 BQCV LAMP 和PCR 檢測引物序列Table 1 The LAMP and PCR detection primer sequences

1.5 BQCV LAMP 反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 根據(jù)DNA LAMP Kit 操作說明，利用以上引物優(yōu)化BQCV LAMP 反應(yīng)體系，參考 LAMP real-time Turbidimeter 儀預(yù)設(shè)參考方案中的標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定反應(yīng)速度曲線峰值超過0.1 時(shí)判定為陽性。利用軟件監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程，以重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，采用不同退火溫度(61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃)試驗(yàn)，選擇最佳退火溫度。

1.6 特異性試驗(yàn) 分別提取BQCV-JL1 株、DWV、SBV、ABPV、CBPV 基因組核酸，采用以上5 種核酸為模板，通過優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)，待反應(yīng)結(jié)束后添加SYBR Green I 5 μL(10 倍稀釋)，觀察陽性管內(nèi)液體顏色及紫外光照射下呈現(xiàn)熒光情況，檢測LAMP 方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn) 將回收的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物克隆于pGEM-T 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-BQCV，采用紫外分光光度計(jì)測定其濃度，根據(jù)公式Y(jié)(拷貝/μL)=X(g/μL)DNA×6.02×1023/DNA 長度(bp)×660 換算為拷貝數(shù)。重組質(zhì)粒pGEM-BQCV 經(jīng)測序鑒定后用限制性內(nèi)切酶酶切線性化，利用Riboprobe System-T7 試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得模板RNA，純化后反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，并將其進(jìn)行倍比系列稀釋后作為模板進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增確定其檢測的敏感性。

1.8 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn) 采用同一批次提取的3個不同濃度(4×104拷貝/μL、4×105拷貝/μL、4×106拷貝/μL)BQCV DNA 作為模板進(jìn)行3 次LAMP 擴(kuò)增，利用LAMP real-time Turbidimeter 儀分析最大擴(kuò)增速率，計(jì)算變異系數(shù)(CV)；再選取3 個不同批次提取的BQCV DNA 作為模板進(jìn)行3 次LAMP 檢測，計(jì)算CV 值，確定LAMP 方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.9 臨床樣品的檢測 對從部分省份采集的40 份疑似病蜂樣品(DNA 提取方法同1.4)進(jìn)行常規(guī)PCR和LAMP 方法檢測，并比較兩種方法檢出率。

2 結(jié)果

2.1 LAMP 目的片段的驗(yàn)證與測序分析 以BQCV的RNA 反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA 為模板，采用引物F3和B3 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳得到約200 bp 目的片段(圖略)，大小與預(yù)期相符。擴(kuò)增片段經(jīng)測序后利用NCBI 中Blast 與GenBank 中KM255693.1、HG779865.1、JX679491.1、JX679489.1、AB746348.1、AB746347.1、JX149518.2、AB723738.1、JN379018.1 進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示同源性達(dá)100%，表明用該引物可以檢測到BQCV。

2.2 LAMP 反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 經(jīng)優(yōu)化后BQCV LAMP 反應(yīng)體系見表2，根據(jù)得出的LAMP反應(yīng)體系對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示63 ℃為最佳溫度。

表2 BQCV LAMP 反應(yīng)體系Table 2 The LAMP reaction system of BQCV

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果 利用建立的LAMP 方法對BQCV-JL1 株、DWV、SBV、CBPV、ABPV 病毒基因組核酸進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：利用軟件監(jiān)控顯示當(dāng)LAMP Turbidimeter 溫度到達(dá)63 ℃時(shí)，23 min 后僅BQCV-JL1 為陽性，其它樣品均為陰性，與普通PCR 檢測BQCV 特異性結(jié)果一致(圖1)。反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR Green I 后管內(nèi)顏色情況、紫外光下產(chǎn)物呈現(xiàn)熒光情況與real-time Turbidimeter 儀檢測結(jié)果一致，表明該方法具有較好的特異性。

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 重組質(zhì)粒pGEM-BQCV 經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測核酸含量為8.91 pg/μL，換算拷貝數(shù)為4.0×107拷貝/μL。按照Riboprobe System-T7 試劑盒說明轉(zhuǎn)錄合成RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，將其進(jìn)行倍比系列稀釋，利用LAMP 進(jìn)行擴(kuò)增，并以real-time Turbidimeter LA-320 檢測敏感性，結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP 體系檢測方法最低檢測濃度為4.0×102拷貝/μL，而PCR 最低檢測濃度為4.0×104拷貝/μL，LAMP 檢測的靈敏度是PCR 檢測的100 倍。待反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR Green I 后管內(nèi)顏色情況、紫外光照射下產(chǎn)物呈現(xiàn)熒光情況與real-time Turbidimeter 儀檢測結(jié)果一致(圖2)。表明該方法具有較高敏感性。

圖1 BQCV LAMP 和PCR 特異性試驗(yàn)分析圖Fig.1 Specific test of BQCV LAMP(A)and RT-PCR(B)

圖2 BQCV LAMP 法與PCR 敏感性對比圖及LAMP 可視化圖Fig.2 BQCV LAMP method and the PCR sensitivity comparison chart and LAMP visualization picture

2.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 取同一批次不同濃度和不同批次BQCV DNA 為模板進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增，每個批次3 個重復(fù)，結(jié)果顯示最大擴(kuò)增速率的CV小于10 %(表3)，表明該方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表3 BQCV 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repeatability and stability test results for BQCV

2.6 臨床樣品的檢測 采用建立的BQCV LAMP方法與普通PCR 同時(shí)檢測40 份臨床樣品，結(jié)果顯示，普通PCR 檢出率為72.5 %(29/40)，LAMP 檢出率為87.5 %(35/40)，LAMP 檢出率明顯高于常規(guī)PCR。表明本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP 可用于BQCV 臨床檢測。

3 討論

本研究利用LAMP real-time Turbidimeter LA-320儀針對BQCV 反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控建立了BQCV的實(shí)時(shí)定量LAMP 方法。BQCV 核酸在63 ℃的恒溫條件下反應(yīng)35 min 即可判定結(jié)果，反應(yīng)結(jié)束后在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入了SYBR Green I[8]及紫外光下，實(shí)現(xiàn)了LAMP 的可視化，使結(jié)果更為直觀。應(yīng)用建立的LAMP 法僅BQCV 可見特異性擴(kuò)增，而DWV、SBV、CBPV、ABPV 均無擴(kuò)增，表明該方法具有較好的特異性；由于BQCV 為RNA 病毒，在反轉(zhuǎn)錄制備cDNA 過程中的效率并不是100 %，將導(dǎo)致嚴(yán)重的系統(tǒng)誤差，因此本研究先將目的片段克隆于含有體外轉(zhuǎn)錄的T7 或T3 啟動子質(zhì)粒中，并通過紫外分光光度計(jì)檢測含量，確定其初始拷貝數(shù)，再通過體外轉(zhuǎn)錄方法獲得RNA 片段，以其為模板反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，倍比稀釋檢測其敏感性[8]，結(jié)果顯示檢出最低限量可達(dá)4.0×102拷貝/μL，是普通PCR 的100 倍，通過體外轉(zhuǎn)錄過程使得敏感性檢測結(jié)果更為完善；對同一批次和不同批次樣品進(jìn)行重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)，最大擴(kuò)增速率的變異系數(shù)均小于10%，說明該方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性；對40 份不同臨床樣品應(yīng)用常規(guī)PCR 和LAMP 法檢測，LAMP法檢出率為87.5 %，而普通PCR 檢出率為72.5 %，表明該方法準(zhǔn)確度高于常規(guī)PCR，能有效減少假陰性出現(xiàn)。

LAMP 法只需恒溫環(huán)境便可對靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，省時(shí)且成本低，較PCR 方法更為快捷和準(zhǔn)確，為快速檢測BQCV 提供了一定的理論依據(jù)。本研究建立了BQCV LAMP 的檢測方法，在較短時(shí)間便可完成檢測，并且檢出最低限量比普通PCR 高100 倍，在檢驗(yàn)準(zhǔn)確度與普通PCR 結(jié)果一致的情況下，操作更為簡便，為快速檢測BQCV 提供了一種方法。

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