豬博卡病毒1/2 型NS1 基因與3/4/5 型VP1 基因的雙重PCR 檢測方法的建立

喬 涵，付朋飛，張 磊，楊興武，潘鑫龍，郭曉慶，陳紅英*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 451450)

豬博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)屬于細小病毒亞科、博卡病毒屬，為單股線狀無囊膜DNA病毒，基因組約5 200 bp[1]。PBoV 于2009 年首次從表現(xiàn)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的瑞典發(fā)病豬群中檢出并鑒定[1]。流行病學(xué)調(diào)查表明，在患有呼吸系統(tǒng)疾病和PMWS 的豬群中PBoV 檢出率明顯高于健康豬群中檢出率[2-5]。同時，從患病仔豬中分離鑒定了多種與腹瀉相關(guān)的新病毒，其中PBoV在豬群中的高感染率38%以上，已引起了廣泛關(guān)注[6]。

PBoV 除了與細小病毒科其他成員同有2 個開放閱讀框架(ORFl 和ORF2)之外，在ORFl 和ORF2之間還存在第3 個ORF(ORF3)。ORFl 編碼1 個與病毒基因復(fù)制有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，ORF2 編碼2個衣殼蛋白(VP1 和VP2)，ORF3 編碼1 個高度磷酸化的功能尚未弄清的非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)。根據(jù)ORF2編碼的VPl 病毒蛋白的不同，將PBoV 分為5 個型(PBoVl～PBoV5)。PBoV 作為新發(fā)現(xiàn)的一種病毒，目前在其致病性、檢測方法以及穩(wěn)定的體外培養(yǎng)系統(tǒng)等方面的研究還比較少，能同時檢測5 種基因型的方法更未見報道。本研究根據(jù)PBoV1/2 型NS1 基因和3/4/5 型VP1 基因序列的高度保守區(qū)域，建立了一種快速和敏感的PBoV 不同基因群的雙重PCR檢測方法，該方法對PBoV 的病原學(xué)流行病調(diào)查提供了新的技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株及病料樣品 豬圓環(huán)病毒(PCV2)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)、沙門氏菌(Salmonella)、大腸桿菌(E.coli)均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物實驗室保存。病料采自河南省新鄭市某豬場，并由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 2×Taq MasterMix 購自北京康為世紀生物科技有限公司；AXYGEN DNA 凝膠回收試劑盒購自天馳生物科技有限公司；DNA Marker 和pMD18-T 載體均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計 參考GenBank 中登錄的PBoV 基因型序列(HM053693、HM053694、F713714、JF42983)，根據(jù)PBoV1/2 型NS1 基因和3/4/5 型VP1 基因序列的高度保守區(qū)域，采用Obligo7.0 基因分析軟件，設(shè)計了兩對特異性引物。引物A1/A2(5'-GCGTGTACT GCGACTGCGTGTT-3'/5'-CGACCTGGCGTTTATTAA CCGAGA-3')擴增PBoV1/2，擴增片段長度為327 bp；引物B1/B2(5'-TGGGACACGTTCGACCTGATG-3'/5'-CCTTGATGACCGTGACGTACT-3')擴 增PBoV3/4/5，擴增片段為209 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 單項PCR 擴增 采用蛋白酶K 法提取PBoV DNA。PBoV1/2 和PBoV3/4/5 的單項PCR 擴增反應(yīng)均采用25 μL 反應(yīng)體系。反應(yīng)程序為94 ℃5 min；94 ℃1 min、53 ℃45 s、72 ℃1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃8 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 雙重PCR 擴增 在PBoV1/2 和PBoV3/4/5 基因的單項PCR 擴增的基礎(chǔ)上，采用方陣試驗進行了雙重PCR 擴增條件優(yōu)化，分別對雙重PCR 反應(yīng)體系中退火溫度、引物間比例、模板量、Taq 酶濃度等條件進行預(yù)試驗，最終確定最佳的雙重PCR 方法的擴增條件。

1.6 雙重PCR 的特異性試驗 對PBoV 病料樣品、PRV、PPV、PCV2、Salmonella、E.coli 核酸，應(yīng)用優(yōu)化的雙重PCR 方法分別進行檢測，并設(shè)無模板系統(tǒng)陰性對照，以驗證該方法的特異性。

1.7 雙重PCR 的靈敏度試驗 采用本實驗構(gòu)建的重組質(zhì)粒(pMD-PBoV1/2 和pMD-PBoV3/4/5)作為標(biāo)準(zhǔn)陽性對照，檢測雙重PCR 方法的敏感性。通過紫外分光光度計測定重組質(zhì)粒的OD260nm和OD280nm值，并根據(jù)公式計算重組質(zhì)粒的純度和濃度。用去離子水對其10 倍梯度稀釋，取2 μL 每個稀釋度質(zhì)粒DNA，按照已建立的雙重PCR 方法進行擴增。

1.8 雙重PCR 的重復(fù)性試驗 采用建立的雙重PCR 方法，對來自不同地區(qū)的3 份陽性病料提取的DNA 重復(fù)PCR 擴增3 次，共擴增9 次(3×3)，重復(fù)多孔同步檢測，考察重復(fù)性。

1.9 臨床樣品檢測 從河南省部分規(guī)模化豬場采集仔豬腹瀉臨床樣品20 份，健康豬腸道樣品10 份，提取DNA，采用建立的雙重PCR 檢測方法進行擴增，并與單項PCR 檢測結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果

2.1 單項PCR 擴增結(jié)果 利用兩對引物A1/A2 和B1/B2，以各型PBoV DNA 為模板，分別進行PCR擴增，擴增出了約300 bp 和200 bp 的特異性片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。將回收的PCR 產(chǎn)物克隆到pMD18-T 載體中進行測序，結(jié)果表明所克隆的PBoV1/2 NS1 基因與參照的HM053693 株序列同源性為96.1 %；PBoV3/4/5 VP1 基因序列與參照的JF71371 株序列同源性為94.7 %，表明PCR 擴增是特異的。

圖1 PBoV1/2 和PBoV3/4/5 檢測目的基因的PCR 擴增Fig.1 PCR amplifications of the DNA fragments for PBoV1/2 and PBoV3/4/5 detection

2.2 雙重PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果 以PBoV DNA為模板，通過方陣試驗，最終確定了雙重PCR 擴增的最佳條件：PCR 反應(yīng)體系為模板DNA 3 μL；PBoV1/2 的上、下游引物(25 pmol/μL)各為0.5 μL，PBoV3/4/5 的上、下游引物(25 pmol/μL)各為0.5 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL；ddH2O 8.5 μL，總體積為25 μL。PCR 擴增條件為：94 ℃5 min；95 ℃45 s、53 ℃45 s、72 ℃1 min，35 個循環(huán)；72 ℃8 min，4 ℃15 min。

2.3 雙重PCR 的特異性試驗結(jié)果 采用優(yōu)化的雙重PCR 反應(yīng)條件對多種豬腹瀉病病原核酸進行擴增。結(jié)果顯示，從PBoV 病料中可同時擴增出PBoV1/2 的約300 bp 和PBoV3/4/5 的約200 bp 的2個片段，而PRV、PPV、PCV2、Salmonella、E.coli及陰性對照均無目的片段(圖2)，表明本研究建立的雙重PCR 具有良好的特異性。

2.4 雙重PCR 的靈敏度試驗結(jié)果 將23 ng/μL(約109拷貝/μL)的PBoV1/2 重組質(zhì)粒和31 ng/μL(約1010拷貝/μL)的PBoV3/4/5 重組質(zhì)粒倍比稀釋后進行雙重PCR 靈敏性試驗。結(jié)果顯示能夠擴增出PBoV1/2 和PBoV3/4/5 重組質(zhì)粒的最大稀釋度為107(圖3)。表明雙重PCR 對PBoV1/2 的檢測下限為102拷貝/μL，對PBoV3/4/5 的檢測下限為103拷貝/μL，具有良好的靈敏性。

圖2 雙重PCR 的特異性試驗Fig.2 The specific test of duplex PCR

圖3 靈敏性試驗結(jié)果Fig.3 The sensitivity test of the duplex PCR assay

2.5 雙重PCR 的重復(fù)性試驗結(jié)果 采用本實驗建立的雙重PCR 方法，對來自不同地區(qū)的3 份陽性病料提取的DNA 重復(fù)PCR 擴增3 次，共擴增9 次(3×3)，每次PCR 擴增結(jié)果均為陽性，表明該方法具有很好的可重復(fù)性。

2.6 臨床樣品的檢測 應(yīng)用PBoV1/2 和PBoV3/4/5的單項PCR 方法和本實驗建立的雙重PCR 方法對來自河南省部分豬場內(nèi)的30 份豬病料樣品進行檢測，結(jié)果顯示，單項PCR 與雙重PCR 檢測符合率為100%。其中10 份為PBoV1/2 陽性，5 份為PBoV3/4/5 陽性，并且有3 份病料為PBoV1/2 和PBoV3/4/5混合感染(表1)。表明該方法可以用于PBoV 臨床鑒別檢測。

表1 兩種方法對30 份病料樣品的PBoV1/2 和PBoV3/4/5檢測結(jié)果Table 1 The results of 30 samples detected by two methods for PBoV1/2 and PBoV3/4/5

3 討論

在PBoV 的研究中，針對其基因型分型、致病性、感染性克隆、穩(wěn)定的體外培養(yǎng)系統(tǒng)、鑒別診斷方法等方面的研究還比較薄弱。在PBoV 檢測方面，目前主要采用的是PCR 擴增、熒光定量PCR 擴增技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)和間接免疫熒光技術(shù)等[7]。雙重PCR 法具有快速、特異性高、操作簡便、重復(fù)性好、一次試驗即可同時檢測大批量樣本等優(yōu)點。本研究根據(jù)GenBank 中登錄的PBoV 5 種基因型核苷酸序列設(shè)計了兩對特異性引物，通過擴增條件優(yōu)化，建立了PBoV 的雙重PCR 檢測方法。應(yīng)用建立的PBoV 的雙重PCR 檢測方法，檢測PBoV 病料樣品、PRV、PPV、PCV2、Salmonella、E.coli 核酸，結(jié)果表明，僅PBoV 病料樣品中可同時擴增出 2 個片段，而對 PRV、PPV、PCV2、Salmonella、E.coli 核酸擴增均為陰性，具有良好的特異性；其對PBoV1/2 的檢測下限為102拷貝/μL，對PBoV3/4/5 的檢測下限為103拷貝/μL，具有良好的敏感性。

應(yīng)用該方法對2013 年10 月～2014 年5 月間實驗室收集的來自河南省的20 份腹瀉仔豬病料和10份健康豬病料進行了檢測，共檢出PBoV 陽性樣品15 份，陽性率達到50 %，這與四川、湖北、湖南等省豬場腹瀉仔豬中PBoV 檢出率相似[7-8]。

本研究建立的雙重PCR 方法可以快速檢測并區(qū)分1/2 和3/4/5 型的PBoV，可用于PBoV1/2 和3/4/5的分型檢測及流行病學(xué)調(diào)查。

[1]McMenamy M J,McKillen J,McNair I,et al.Detection of a porcine boca-like virus in combination with porcine circovirus type 2 genotypes and Torque teno sus virus in pigs from postweaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)-affected and non-PMWS-affected farms in archival samples from Great Britain[J].Vet Microbiol,2013,164(3-4):293-298.

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[4]Madec F,Rose N,Grasland B,et al.Post·weaning multisysremit wasting syndrome and other PCV2-related problems in pigs:a 12-year experience[J].Transbound Emerg Dis,2008,55(7):273-283.

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[7]胡軍勇，張倩，王丹丹，等.豬博卡病毒PCR 檢測方法的建立及其初步流行病學(xué)調(diào)查[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，34(8)：632-636.

[8]蔡雨函，朱玲，周遠成，等.豬博卡病毒雙重PCR 檢測方法的建立及其應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2013，43(08)：833-838.