虎源細(xì)小病毒的分離鑒定及其VP2 基因分析

劉永相，李秀云，劉 鑫，蔣艷妹，郭冬春，田 進(jìn)，仇 錚，鄒希明,*，曲連東*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001；2.北方森林動物園，黑龍江 哈爾濱 150332)

貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PLV)又稱貓細(xì)小病毒、貓傳染性腸炎病毒或貓瘟熱病毒。引起的傳染病主要以高熱、嘔吐、白細(xì)胞嚴(yán)重減少和腸炎為特征[1]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PLV在自然條件下能夠感染多種野生貓科動物，如獅子、老虎、豹以及水貂等[2]。

FPLV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白為VP1 和VP2，VP2 是衣殼蛋白的主要組成成分，而正是VP2 的個別關(guān)鍵氨基酸決定了細(xì)小病毒不同抗原型的宿主范圍和生物學(xué)特征[3]，因此很有必要對VP2 基因序列進(jìn)行深入研究。FPLV 的抗原變異還導(dǎo)致了新病毒的出現(xiàn)。1977 年～1978 年間開始流行的細(xì)小病毒被證明其基因遺傳關(guān)系與FPLV 最為接近，核苷酸變異不到百分之一，而且變異多集中在VP2 序列中[4]。FPLV 的宿主譜正在不斷的變大，2008 年，楊松濤等從腹瀉猴體內(nèi)分離到細(xì)小病毒，并且VP2 的10 個關(guān)鍵氨基酸位點中有8 個與FPLV 的相同[5]。

老虎作為瀕危的珍惜野生保護(hù)動物，近年來受到越來越多病毒的威脅，目前感染虎的病毒有細(xì)小病毒[2]、犬瘟熱病毒、A 型流感病毒、貓杯狀病毒[6]、犬副流感病毒和朊病毒[7]等，所以保護(hù)虎免受病毒的威脅變得越來越迫切。

在東北虎源病毒生態(tài)多樣性的研究中，發(fā)現(xiàn)從東北虎糞便樣品中擴(kuò)增出細(xì)小病毒基因，通過細(xì)胞分離鑒定獲得了一株虎源細(xì)小病毒HRB-T2014，并且對其VP2 基因序列進(jìn)行克隆及遺傳進(jìn)化分析。

1 材料和方法

1.1 虎糞便樣品收集及處理 從哈爾濱地區(qū)某動物園采集了若干只東北虎的糞便樣品，其中一部分為腹瀉樣品，部分為血便樣品。所有樣品均分為兩份，分別進(jìn)行單獨存放并做好標(biāo)記，一部分用于病毒分離鑒定，于-70 ℃凍存；另一部分用于病毒宏基因組測序。將用于病毒宏基因組測序的樣品混合后，用PBS 進(jìn)行10 倍稀釋，反復(fù)凍融3 次，進(jìn)行差速離心，上清液用0.22 μm 濾膜進(jìn)行過濾。濾液進(jìn)行超速離心，用5 mL PBS 重懸沉淀，分裝后于-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 pMD18-T 載體、Ex Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、DL2000 DNA Marker 購自TaKaRa 公司；AxyPrep 體液病毒DNA/RNA 小量制備試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)文獻(xiàn)合成肉食動物細(xì)小病毒通用鑒定引物[8]，Uni-F：5'-GTAAGCTTCCA GGAGACTTT-3'/Uni-R：5'-GTAAGCTTCGTCGTGTT CTT-3'，擴(kuò)增片段約為660 bp。根據(jù)文獻(xiàn)合成FPLV VP2 全基因序列的引物[9]，VP2-F：5'-ATGAGT GATGGAGCAGTTC-3'/VP2-R：5'-AATATAATTTTC TAGGTGCTAG-3'，擴(kuò)增片段為1 755 bp。引物由哈爾濱博士生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 病毒宏基因組測序及分析 取300 μL 超速離心虎糞懸液，依次進(jìn)行酶處理，核酸提取，反轉(zhuǎn)錄，核酸隨機(jī)擴(kuò)增，PCR 純化[10]，純化的PCR 產(chǎn)物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行病毒宏基因組測序。將所得序列通過GenBank 的數(shù)據(jù)庫BLASTn和BLASTr 比對，并通過生物信息學(xué)分析去除無關(guān)的細(xì)菌和真核生物基因序列，獲得病毒序列。

1.5 細(xì)小病毒PCR 鑒定 參考AxyPrep 體液病毒DNA/RNA 小量制備試劑盒說明書，提取虎糞樣品中的核酸，利用引物Uni-F/Uni-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[8]。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 病毒的分離、純化及電鏡觀察 將PCR 鑒定為細(xì)小病毒陽性的樣品，采用PBS 進(jìn)行10 倍稀釋，反復(fù)凍融3 次，進(jìn)行差速離心，上清液用0.22 μm濾膜進(jìn)行過濾。將濾液與DMEM(含2 %血清)培養(yǎng)基按1∶10 的比例同步接種CRFK 細(xì)胞，于37 ℃5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，反復(fù)凍融3 次收集病毒，進(jìn)行蝕斑純化。取1 mL 純化后的病毒，3 000 r/min 離心15 min，取上清，12 000 r/min離心30 min，將沉淀用100 μL PBS 重懸，經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后電鏡觀察。

1.7 VP2 基因克隆及序列分析 按照上述方法提取純化病毒的DNA，以其為模板，用FPLV VP2 基因特異性引物VP2-F/VP2-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[9]，并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆于pMD18-T 載體中進(jìn)行測序鑒定。將測序結(jié)果采用DNAStar 程序中的SeqMan 軟件進(jìn)行序列拼接，進(jìn)行Blast 比對。利用MegAlign 軟件將VP2 基因核苷酸和氨基酸序列與細(xì)小病毒參考病毒株進(jìn)行同源性比對。用MEGA5.0 軟件中的鄰接法構(gòu)建VP2 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒宏基因組測序結(jié)果 經(jīng)過Illumina HiSeq2000 高通量測序，共得到3 200 000 000 條讀長(Reads)，并拼接出6 766 條重疊序列(Contig)，contig 全長為8 451 561 bp。其中大量序列對應(yīng)于細(xì)小病毒，包括犬細(xì)小病毒、貓細(xì)小病毒和貂細(xì)小病毒等。病毒宏基因組學(xué)技術(shù)作為一種研究方法，通過以某一群落全部病毒為研究對象，對所有病毒核酸進(jìn)行測序和分析，能夠從病原生態(tài)學(xué)水平了解一定群落的病毒組成。本研究通過對東北虎糞便樣品進(jìn)行病毒宏基因組學(xué)分析時發(fā)現(xiàn)其中存在大量細(xì)小病毒基因序列，提示病料樣品中存在細(xì)小病毒。

2.2 細(xì)小病毒通用引物的鑒定 在病毒宏基因組測序結(jié)果的基礎(chǔ)上，用肉食動物細(xì)小病毒通用檢測引物對采集的樣品進(jìn)行PCR 驗證，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示在約660 bp 處出現(xiàn)特異性片段，與預(yù)期相符，表明病料樣品中存在細(xì)小病毒(圖略)。

2.3 病毒分離、純化及電鏡觀察 將PCR 鑒定為陽性的樣品接種CRFK 細(xì)胞后3 d 即出現(xiàn)細(xì)胞變圓，貼壁不牢，折光性加強(qiáng)，聚集成團(tuán)，并陸續(xù)脫落。并在細(xì)胞上形成形態(tài)較小的蝕斑。純化的病毒負(fù)染后，經(jīng)透射電鏡觀察可見到典型的細(xì)小病毒病毒粒子，直徑約為20 nm，呈球形或卵圓形。病毒命名為FPLV HRB-T2014。

2.4 細(xì)小病毒VP2 基因的克隆及序列分析 采用FPLV VP2 基因特異性引物對純化病毒的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示在約1 700 bp 出現(xiàn)特異性片段，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。對FPLV 分離株HRB-T2014 的VP2 基因核酸序列分析表明，其與中國虎源分離株FJ405225 和HT-374 相似性最高，為99.9 %，而與犬細(xì)小病毒cpvnj01-06 相似性僅為98.1 %。

圖1 VP2 基因的PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplication of VP2 gene

前期研究表明VP2 蛋白有10 個關(guān)鍵性氨基酸位點影響細(xì)小病毒抗原型宿主范圍及生物學(xué)特性，其中80、93、103、323、564 和568 位6 個氨基酸主要決定宿主差異(表1)。當(dāng)80、564 和568 位分別為賴氨酸(K)、天冬酞胺(N)和丙氨酸(A)時，細(xì)小病毒只能在貓體內(nèi)增殖，但當(dāng)93、103 和323 位分別為N、A 和N 時，細(xì)小病毒則只能感染犬而不能感染貓，而本研究中，虎源分離株HRB-T2014 符合FPLV 的分子特征，這也恰恰符合了老虎屬于貓科動物的特征。

表1 VP2 蛋白中10 個關(guān)鍵氨基酸位點Table 1 Ten key amino acid sites of VP2

2.5 VP2 基因的進(jìn)化分析 將FPLV HRB-T2014 株VP2 基因的核苷酸序列與NCBI 中登錄的34 株細(xì)小病毒VP2 基因核酸序列進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，F(xiàn)PLV HRB-T2014 株與HT-374 株和FJ405225 株進(jìn)化距離最近，并與貓源、虎源和貂源細(xì)小病毒共位于FPLV 分支，而與犬細(xì)小病毒處于兩個獨立的分支(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化分析進(jìn)一步證明分離株HRB-T2014 起源于FPLV。

然而，值得注意的是，當(dāng)323 和564 位分別為N 和絲氨酸時，F(xiàn)PLV 能夠感染靈長類動物[5]，這表明FPLV 通過遺傳變異具有了跨種間傳播的潛在風(fēng)險。因此，加強(qiáng)FPLV 的分子流行病學(xué)和遺傳變異機(jī)制的研究對保護(hù)野生動物具有重要的意義。

[1]Stuetzer B,Hartmann K.Feline parvovirus infection and associated diseases[J].Vet J,2014,201(2):150-155.

[2]楊松濤，王立剛，戈銳，等.虎源貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的分離鑒定[J].獸類學(xué)報，2007，27(2)：170-174.

[3]梁萌，王化磊，馮昊，等.我國2 株野生動物源細(xì)小病毒VP2 和NS1 基因序列及所編碼蛋白的分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2013，33(3)：345-351.

[4]趙建軍，閆喜軍，吳威.犬細(xì)小病毒：從起源到進(jìn)化[J].微生物學(xué)報，2011，51(7)：869-875.

[5]Yang Song-tao,Wang Shu-jun,Feng Hao,et al.Isolation and characterization of feline panleukopenia virus from a diarrheic monkey[J].Vet Microbiol,2010,143(2-4):155-159.

[6]高玉偉，夏咸柱，扈榮良，等.獵豹與虎貓杯狀病毒的分離及其超變區(qū)基因比較研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2003，25(3)：179-182.

[7]吳長德，趙德明，楊建民，等.東北虎朊病毒基因的克隆與序列分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2007，29(3)：190-193.

[8]劉維全，范泉水，江禹，等.肉食獸細(xì)小病毒通用PCR 診斷技術(shù)的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2001，21(3)：249-251.

[9]許冬蕾，任常寶，張曉戰(zhàn)，等.廣州地區(qū)犬細(xì)小病毒VP2基因的序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40(12)：38-42.

[10]He Biao,Li Zuo-sheng,Yang Fan-li,et al.Virome profiling of bats from Myanmar by metagenomic analysis of tissue samples reveals more novel Mammalian viruses[J].PLoS One,2013,8(4):e61950.