豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9 與宿主CALM2 基因編碼鈣調(diào)蛋白的相互作用研究

胡 亮，郭東偉，李江南，尹曼曼，黃 麗，翁長江

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/動物病原監(jiān)測與分子流行病學(xué)團隊，黑龍江 哈爾濱 150001)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)為一類高度接觸性傳染病，以引起嚴(yán)重繁殖障礙、呼吸道疾病、哺乳仔豬死亡率增加和持續(xù)繼發(fā)性感染為主要特征，對目前養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[1]。該病病原為PRRS 病毒(PRRSV)，其基因組為單股正鏈RNA，至少含有10個開放閱讀框(ORF)，編碼8 個結(jié)構(gòu)蛋白和14 個非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。其中，非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9 為該病毒RNA依賴的RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)。動脈炎病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(RTC)體外分離實驗表明Nsp9 可能同多個病毒蛋白和宿主因子一起組裝形成膜附著的RTC，在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用[3]。因此，篩選并研究與Nsp9 相互作用的宿主蛋白對了解Nsp9 功能及PRRSV 復(fù)制機理具有重要意義。

本研究采用酵母雙雜交方法，以Nsp9 為誘餌蛋白，從實驗室構(gòu)建的豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)酵母表達cDNA 文庫中篩選與其相互作用的宿主蛋白，結(jié)果鑒定出宿主CALM2(Calmodulin 2)基因編碼的鈣調(diào)蛋白(CaM)與Nsp9 存在相互作用，為進一步深入研究PRRSV 復(fù)制和致病的分子機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞和酵母表達文庫PRRSV HuN4 株、E.coli DH5α 感受態(tài)、pFlag-CMV4和pCMV-HA 真核表達載體、HEK293 細(xì)胞、PAM細(xì)胞cDNA 及其酵母表達文庫均由本實驗室保存；酵母表達載體pGBKT7(pBD)、pGADT7(pAD)及酵母菌株Y2H 和Y187 均購自Clontech 公司。

1.2 主要試劑 酵母質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；酵母YPDA、SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp-Leu(SD/-2)、SD/-His-Trp-Leu-Ade(SD/-4)等培養(yǎng)基和Aba、X-α-Gal、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒等均購自Clontech 公司；TRIzol 試劑及RT-PCR 試劑盒購自Invitrogen 公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自QIAGEN 公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA 連接酶購自NEB 公司；抗Flag 標(biāo)簽單克隆抗體(MAb)購自Abmart 公司；抗HA 標(biāo)簽MAb 購自Cell Signaling Technology(CST)公司；FITC 標(biāo)記羊抗鼠IgG(IgG-FITC)和羊抗兔IgG-TRITC 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗Flag(M2)瓊脂糖珠、羊抗兔IgG-HRP、4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)均購自Sigma-Aldrich 公司；Super ECL 超敏發(fā)光液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.3 真核重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 提取PRRSV HuN4株RNA 并反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以其為模板通過RT-PCR 擴增nsp9 基因，分別克隆于pFlag-CMV4和pBD 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFlag-nsp9 和pBDnsp9；根據(jù)GenBank 中豬CALM2(XM_003125163)的核苷酸序列設(shè)計引物，以PAM 細(xì)胞cDNA 為模板擴增CALM2 基因，分別克隆于pCMV-HA 和pAD載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHA-CALM2 和pADCALM2(相關(guān)引物序列見表1)。

表1 實驗所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 誘餌蛋白的自激活活性和毒性檢測 將誘餌重組質(zhì)粒pBD-nsp9 和空載體pAD 共轉(zhuǎn)化Y2H 酵母菌株，分別涂于SD/-2、SD/-4、SD/-4/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A)平板，培養(yǎng)3 d～5 d 后觀察并比較各種平板上菌落的生長情況。pAD-T 與pBD-p53 共轉(zhuǎn)化作為陽性對照，pAD-T 和pBD-Lam 共轉(zhuǎn)化作為陰性對照。

1.5 酵母雙雜交試驗 將pBD-nsp9 轉(zhuǎn)化后的Y2H酵母菌培養(yǎng)于SD/-Trp 瓊脂培養(yǎng)基，挑取形態(tài)規(guī)則的單菌落接種于SD/-Trp 液體培養(yǎng)基，隨后與PAM細(xì)胞cDNA 酵母表達文庫進行雜交。收集、重懸菌體，涂布于SD/-4 平板。再將生長的單克隆菌體接種至SD/-4/X/A 平板，進行另一輪篩選。最后，挑選藍色陽性克隆進行菌落PCR、測序和NCBI blast分析，以確定捕獲的宿主蛋白。

1.6 酵母回返驗證試驗 將pBD-nsp9 與pAD-CALM2共轉(zhuǎn)化感受態(tài)Y2H 酵母菌，分別涂于SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A 平板，觀察平板上菌落生長情況。pBD空載體與pAD-T 共轉(zhuǎn)化作為陰性對照，pBD-p53 與pAD-T 共轉(zhuǎn)化作為陽性對照，pBD 空載體與pADCALM2 共轉(zhuǎn)化作為自激活對照。

1.7 免疫共沉淀(Co-IP)試驗 將pFlag-nsp9 和pHACALM2 分別與pCMV-HA 空載體共轉(zhuǎn)染或pFlagnsp9 和pHA-CALM2 共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，收集并裂解細(xì)胞，低溫高速離心后收集上清。取部分細(xì)胞上清與抗Flag(M2)瓊脂糖珠孵育，然后收集瓊脂糖珠并利用細(xì)胞裂解緩沖液進行清洗，以去除結(jié)合不牢的雜蛋白；另一部分細(xì)胞上清作為對照。蛋白樣品經(jīng)變性處理后進行SDS-PAGE 電泳分離，進一步濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜。膜經(jīng)過脫脂乳封閉后，分別以兔源抗HA 標(biāo)簽或抗Flag 標(biāo)簽MAb 為一抗，以羊抗兔IgG-HRP 為二抗，于暗室通過X 光片曝光進行Co-IP 試驗。

1.8 激光共聚焦試驗 將pFlag-nsp9 和pHA-CALM2共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，細(xì)胞依次經(jīng)多聚甲醛固定，Triton X-100 透膜處理，血清封閉，然后分別以鼠源抗Flag 標(biāo)簽MAb(1∶200)和兔源抗HA 標(biāo)簽MAb(1∶200)為一抗，以羊抗鼠IgG-FITC(1∶100)和羊抗兔IgG-TRITC(1∶100)為二抗，經(jīng)DAPI 染色后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞并拍照。

2 結(jié)果

2.1 酵母雙雜交篩選與Nsp9 蛋白相互作用的宿主蛋白 將誘餌重組質(zhì)粒pBD-nsp9 與pAD 空載體共轉(zhuǎn)化Y2H 酵母菌株，結(jié)果顯示，重組菌不能夠在SD/-4 和SD/-4/X/A 平板上生長，表明誘餌蛋白Nsp9無自激活活性。而SD/-2 平板上的菌落與對照組菌落的生長速度和狀態(tài)無明顯差別，表明Nsp9 的表達對酵母無明顯毒性作用。將pBD-nsp9 誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Y2H 酵母菌和PAM 細(xì)胞cDNA 酵母表達文庫進行雜交，篩選獲得的陽性克隆經(jīng)質(zhì)粒提取、測序和NCBI blast 分析顯示，共篩選到18 個陽性克隆所對應(yīng)的序列均為CALM2 基因。

2.2 Nsp9 與CaM 在酵母體系中的相互作用 將pBD-nsp9 和pBD 空載體分別與pAD-CALM2 共轉(zhuǎn)化至Y2H 酵母菌，并分別在SD/-2、SD/-4 和SD/-4/X/A 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。以pBD-p53 和pAD-T 共轉(zhuǎn)化作為陽性對照，pBD-Lam 和pAD-T 共轉(zhuǎn)化作為陰性對照。結(jié)果顯示，pBD-p53 和pAD-T 抗原共轉(zhuǎn)的酵母菌均可在SD/-4 和SD/-4/X/A 培養(yǎng)基正常生長，而pBD-Lam 與pAD-T 抗原共轉(zhuǎn)的酵母菌不能在SD/-4和SD/-4/X/A 培養(yǎng)基正常生長，表明陽性對照和陰性對照均成立。pBD-nsp9 與pAD 及pBD 與pADCALM2 分別共轉(zhuǎn)的酵母菌均不能在SD/-4 和SD/-4/X/A 培養(yǎng)基上生長，表明Nsp9 和CaM 均無自激活現(xiàn)象。pBD-nsp9 與pAD-CALM2 共轉(zhuǎn)化的酵母在SD/-2、SD/-4 和SD/-4/X/A 均能夠正常生長，表明Nsp9 和CaM 在酵母中存在相互作用(圖1)。

圖1 酵母雙雜交試驗驗證Nsp9 與CaM 的相互作用Fig.1 The interaction of Nsp9 and CaM was identified by Y2H

2.3 Co-IP 試驗驗證Nsp9 和CaM 的相互作用將pFlag-nsp9、pHA-CALM2 分別與pCMV-HA 共轉(zhuǎn)染或pFlag-nsp9 與pHA-CALM2 共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞。對照樣品(Input)通過western blot 檢測，結(jié)果表明CaM 和Nsp9 均正常表達。同時，Co-IP 結(jié)果顯示，CaM 能夠與Nsp9 共沉淀，表明Nsp9 和CaM存在特異性的相互作用(圖2)。

圖2 Co-IP 試驗驗證Nsp9 與CaM 的相互作用Fig.2 The interaction of Nsp9 and CaM was confirmed by Co-IP

2.4 激光共聚焦試驗驗證Nsp9 與CaM 在HEK293細(xì)胞中的共定位 將真核表達質(zhì)粒pFlag-nsp9 與pHA-CALM2 共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，以研究Nsp9 和CaM 在HEK293 細(xì)胞中的定位情況。結(jié)果顯示，Nsp9 和CaM 均表達在HEK293 細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)，并呈現(xiàn)重疊分布(圖3)，表明Nsp9 和CaM 在HEK293細(xì)胞內(nèi)存在共定位。

3 討論

圖3 激光共聚焦試驗驗證Nsp9 與CaM 的共定位Fig.3 Co-localization of Nsp9 and CaM in the cytoplasma of HEK293 cell

所有的正鏈RNA 病毒均編碼RdRp，其作為關(guān)鍵的催化亞基與多個病毒蛋白和宿主因子共同參與病毒基因組的復(fù)制過程[4]。Li 等利用反向遺傳操作平臺逐一替換PRRSV 高致病株RvJXwn 和低致病株RvHB-1/3.9 的基因組片段后，發(fā)現(xiàn)Nsp9 和Nsp10兩個基因共同決定了高致病PRRSV 的致病力和復(fù)制效率[5]。此外，siRNA 干擾Nsp9 的表達后可以顯著抑制PRRSV 的復(fù)制[6]。表明Nsp9 作為PRRSV 的RdRp 對于病毒的復(fù)制和毒力非常關(guān)鍵。由于病毒復(fù)制過程需要宿主蛋白的參與，因而研究Nsp9 與宿主蛋白的相互作用非常重要。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)宿主蛋白Annexin A2 與Nsp9 相互作用并有利于PRRSV 的復(fù)制[7]；同時還發(fā)現(xiàn)宿主蛋白RACK1 與Nsp9 存在相互作用[8]。最近，宿主蛋白DDX5 和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白也被證明可以與Nsp9 相互作用，并且參與調(diào)節(jié)PRRSV 的復(fù)制[9-10]。表明多個宿主蛋白能夠與Nsp9 相互作用并參與調(diào)控PRRSV 復(fù)制過程。本研究以Nsp9 蛋白為誘餌，通過酵母雙雜交系統(tǒng)從PAM 細(xì)胞酵母表達cDNA 文庫中篩選到一個與其相互作用的新宿主蛋白-CaM，并進一步通過酵母回返試驗和Co-IP 試驗驗證了這兩個蛋白間的相互作用以及激光共聚焦試驗證明兩個蛋白在HEK293 細(xì)胞胞漿內(nèi)存在共定位分布。

CaM 是真核細(xì)胞參與調(diào)節(jié)鈣信號通路的關(guān)鍵蛋白。CaM 結(jié)合Ca2+后形成Ca2+/CaM 復(fù)合物，進而結(jié)合靶蛋白的自身抑制結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)靶蛋白的生物學(xué)活性，參與諸如細(xì)胞分裂、新陳代謝、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列基本的細(xì)胞生理過程[11]。哺乳動物中，CaM 分別由3 個處于不同染色體上具有自身獨立啟動子和內(nèi)含子區(qū)的基因編碼，即CALM1、CALM2 和CALM3。這3 個基因可以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生5 個5'UTR 或3'UTR 存在序列和長度差異的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但卻均編碼一個相同的具有149 個氨基酸的蛋白CaM[12]。同時，這些基因分別獨立受到調(diào)控，相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在不同的組織和病理條件下水平不一致。如關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞CALM2 基因表達水平最高，并且CALM1 和CALM2 基因的高水平表達與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生存在相關(guān)性[13]；增生性畸形瘤細(xì)胞CALM3 基因表達量最高[14]；退行性大細(xì)胞淋巴瘤中CALM2 基因表達量上調(diào)，并且在多種不同的癌細(xì)胞內(nèi)，如乳腺癌，CaM 的表達量均上調(diào)，表明鈣依賴性細(xì)胞內(nèi)信號的改變可能與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果表明CALM2 基因編碼的CaM 與Nsp9存在相互作用，提示宿主細(xì)胞內(nèi)的鈣信號通路調(diào)節(jié)系統(tǒng)可能參與PRRSV 復(fù)制過程，但直接證據(jù)還有待于進一步的研究。

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