豬腦心肌炎病毒HB10 株cDNA 感染性克隆的構(gòu)建

于會(huì)彬，黃 麗，張?jiān)澹罱?，蔡雪輝，崔尚金，翁長江

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物病原監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江哈爾濱 150001)

豬腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)屬于小RNA 病毒科，心病毒屬，為無囊膜的單股正鏈RNA 病毒[1]。EMCV 基因組全長約7.8 kb，含一個(gè)開放閱讀框(ORF)，編碼一個(gè)多聚蛋白(L-1ABCD-2ABC-3ABCD)，多聚蛋白最終產(chǎn)生13 個(gè)成熟的病毒蛋白，前體蛋白P1 包含衣殼蛋白1A、1B、1C、1D。前體蛋白P2 和P3 包含EMCV 的非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C 蛋白酶和RNA 依賴的RNA 聚合酶3D[2]。

1945 年，在佛羅里達(dá)州的一個(gè)長臂猿體內(nèi)首次分離到EMCV[3]，該病毒呈世界性分布，能夠引起豬的急性、致死性心肌炎或母豬的繁殖障礙[4-5]。其致病性及引起的疾病主要取決于病毒和宿主兩方面因素。最新研究表明，EMCV 2A 蛋白為EMCV 的毒力因子[6]，為進(jìn)一步研究EMCV 2A 及其缺失突變對(duì)病毒致病性的影響，本研究利用反向遺傳操作系統(tǒng)建立了EMCV-HB10 株的cDNA 感染性克隆，為深入研究EMCV 毒力因子及致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 EMCV-HB10 株由崔尚金研究員提供，第5 代病毒用于本實(shí)驗(yàn)研究；E.coli DH5α、低拷貝載體pOK12 及BHK-21 細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；鼠抗VP1 單克隆抗體(MAb)由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 主要試劑 RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6 and T7 購自Promega 公司；RNA提取試劑TRIzol Reagent、Super Script III First-Strand Synthesis System 和Lipofectamine 2000 購自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自QIAGEN 公司；Phusion High-Fidelity DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購自NEB 公司；羊抗鼠FITC-IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及基因合成 根據(jù)EMCV-HB10 全基因序列(GQ864080.1)，利用Primer5 軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增EMCV 全長基因組cDNA(表1)。引物及所有重組質(zhì)粒測(cè)序均由上海英俊公司完成(全長測(cè)序引物序列信息如讀者需要作者可以提供)。

1.4 EMCV-HB10 感染性重組質(zhì)粒的構(gòu)建 按照TRIzol 試劑說明書提取EMCV RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以EMCV-FL-F/EMCV-FL-R 為引物，采用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase PCR 擴(kuò)增EMCV 全長基因組cDNA，回收純化PCR 產(chǎn)物，經(jīng)Eco RⅠ/Bam HⅠ酶切后克隆于載體pOK12 中，構(gòu)建EMCV 感染性重組質(zhì)粒pOK12-EMCV-HB10，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。EMCV-HB10 全長基因組cDNA 如圖1所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

圖1 含T7 啟動(dòng)子EMCV-HB10 全長基因組cDNA 結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The full length cDNA of EMCV-HB10 with T7 promoter

1.5 RNA 體外轉(zhuǎn)錄及病毒的拯救 重組質(zhì)粒pOK12-EMCV-HB10 經(jīng)Bam HⅠ酶切線性化后，按照RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6 and T7 試劑盒說明書進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，采用酚-氯仿法抽提純化RNA，按Lipofectamine 2000 說明書操作步驟將其轉(zhuǎn)染于80 %的單層BHK-21 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36 h 后，觀察細(xì)胞病變(CPE)，并收獲細(xì)胞上清，連續(xù)體外盲傳5 代，拯救病毒命名為rEMCV-HB10。

1.6 拯救病毒的鑒定

1.6.1 拯救病毒的RT-PCR 測(cè)序鑒定 分別將F5 代0.1 mL 103TCID50的rEMCV-HB10 和EMCV-HB10感染BHK-21 細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，擴(kuò)增全基因組進(jìn)行測(cè)序，序列比對(duì)鑒定。

1.6.2 間接免疫熒光(IFA)鑒定 將F5 代rEMCVHB10 按常規(guī)方法感染80 %單層BHK-21 細(xì)胞12 h后，以鼠抗VP1 MAb(1∶200)為一抗，羊抗鼠FITCIgG(1∶100)為二抗，進(jìn)行IFA 鑒定。同時(shí)設(shè)置無病毒感染細(xì)胞和EMCV-HB10 感染細(xì)胞作為對(duì)照。

1.6.3 拯救病毒的生長特性研究 分別將F5 代100 TCID50的rEMCV-HB10 和EMCV-HB10 感 染BHK-21 細(xì)胞，37 ℃孵育1 h 后換液，分別于不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞上清，測(cè)定病毒TCID50，繪制病毒生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 全長感染性克隆c DNA 重組質(zhì)粒構(gòu)建 提取EMCV RNA 反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以其為模板，利用EMCV-FL-F/EMCV-FL-R 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增獲得EMCV 基因組全長cDNA。將其克隆于載體pOK12 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pOK12-EMCVHB10，酶切鑒定結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖2)。

圖2 全長EMCV cDNA 重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of the full-length recombinant EMCV cDNA clone

2.2 病毒的拯救及RT-PCR 測(cè)序鑒定 重組質(zhì)粒pOK12-EMCV-HB10 經(jīng)Bam HⅠ酶切后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)染RNA 于80 %的單層BHK-21 細(xì)胞，結(jié)果顯示，36 h 后出現(xiàn)典型CPE，細(xì)胞先呈葡萄狀分布、最終崩解成碎片。分別將F5 代0.1 mL 103TCID50的rEMCV-HB10 和EMCV-HB10 感染BHK-21 細(xì)胞，對(duì)病毒全基因組進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明rEMCV-HB10僅1D 基因存在兩個(gè)核苷酸突變A37G 和G187C，該突變可以作為鑒定rEMCV-HB10 的特異性標(biāo)志。

2.3 拯救病毒IFA 鑒定 將EMCV-HB10 和rEMCVHB10 分別感染BHK-21 細(xì)胞后利用抗VP1 MAb 進(jìn)行IFA 檢測(cè)。結(jié)果顯示，EMCV-HB10 和rEMCVHB10 感染的BHK-21 細(xì)胞均可以檢測(cè)到特異性熒光(圖3A 和3B)，而對(duì)照BHK-21 細(xì)胞則無特異性熒光(圖3C)。

圖3 rEMCV-HB10 的IFA 檢測(cè)Fig.3 Identification of the rEMCV-HB10 by IFA

2.4 拯救病毒的生長特性研究 取F5 代100 TCID50EMCV-HB10 和rEMCV-HB10 感染BHK-21 細(xì)胞，于不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞上清，測(cè)定其TCID50。繪制病毒生長曲線。結(jié)果顯示，拯救病毒與親本病毒株具有相似的生長特性(圖4)。

圖4 rEMCV-HB10 和EMCV-HB10 的生長曲線Fig.4 The growth curve of rEMCV-HB10 and EMCV-HB10

3 討論

構(gòu)建病毒cDNA 感染性克隆的關(guān)鍵是獲得高質(zhì)量的病毒RNA，準(zhǔn)確擴(kuò)增病毒全長cDNA。本研究采用高保真酶一次擴(kuò)增病毒全長基因組cDNA，直接克隆于低拷貝載體pOK12 中。拯救病毒全基因組測(cè)序結(jié)果表明，僅1D 基因存在兩個(gè)核苷酸突變，但并不影響病毒拯救。本研究相比其他復(fù)雜的分節(jié)段構(gòu)建感染性克隆策略，節(jié)約時(shí)間和成本。利用該反向遺傳平臺(tái)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)EMCV 基因組的改造，使得病毒基因組核苷酸的突變、基因的替換或缺失成為可能。

EMCV 5'UTR 含有一個(gè)獨(dú)特Poly(C)區(qū)域，長度約60 nt～350 nt[7]。構(gòu)建全長EMCV cDNA 克隆的難度之一在于擴(kuò)增5' 端Poly(C)。已有研究表明，Poly(C)的長度不影響病毒在細(xì)胞中的生長特性[8]，但對(duì)病毒致病力有影響。本研究中rEMCV-HB10 基因組測(cè)序結(jié)果顯示，該拯救病毒的Poly(C)序列長度為15 nt，親本EMCV-HB10 的Poly(C)序列長度為24 nt。生長特性研究表明拯救病毒與親本病毒的生長特性并無顯著差異。EMCV 的3' 端的Poly(A)在感染中起到重要功能。RNA 的感染需要EMCV RNA 的Poly(A)，此外還可能具有保護(hù)mRNA 不被細(xì)胞內(nèi)核酶降解和起始RNA 合成的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，只有7 nt Poly(A)的全長EMCV cDNA 克隆能夠拯救出病毒，拯救病毒對(duì)小鼠具有致病性[9]。而本實(shí)驗(yàn)拯救病毒Poly(A)測(cè)序長度為15 nt，也可以拯救病毒。該拯救病毒對(duì)宿主的致病性還需要深入研究。

本研究構(gòu)建了EMCV-HB10 株全長cDNA 感染性克隆，為進(jìn)一步研究EMCV 基因的結(jié)構(gòu)與功能、致病機(jī)理以及開發(fā)新型疫苗提供了有效的反向遺傳操作平臺(tái)。

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