HPLC-MS/MS法測定犬體內(nèi)鹽酸苯環(huán)壬酯的血藥濃度及其藥動學(xué)研究Δ

曾 媛，鄭露露，熊 磊，劉 輝#，段 婷（.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科，武漢 430070；.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065）

鹽酸苯環(huán)壬酯（PCH）是我國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所發(fā)明的新一代高選擇性中樞抗膽堿能抗暈動?、耦愋滤嶽1-2]，擁有中國專利2項和英美專利各1項。其制劑鹽酸苯環(huán)壬酯片用于暈動病的防治，具有療效可靠、中樞不良反應(yīng)小的優(yōu)點[3-5]。由于其給藥劑量小（2 mg/d），此劑量下，鹽酸苯環(huán)壬酯的血藥濃度極低[6]，因此需要建立簡單快速、選擇性強且靈敏度高的方法用于血藥濃度檢測。本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）法建立了鹽酸苯環(huán)壬酯片在Bealge犬體內(nèi)的血藥濃度測定方法，為鹽酸苯環(huán)壬酯緩釋制劑的開發(fā)與臨床前研究提供了可靠保證。

1 材料

1.1 儀器

1260 型HPLC 系統(tǒng)，包括二元高壓泵系統(tǒng)、自動進樣器和切換閥（美國Agilent 公司）；API3200 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，包括電噴霧離子化源（美國AB Sciex公司）；Anke TGL-16B型臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸苯環(huán)壬酯對照品（批號：100716-200501，純度：100%）、鹽酸戊乙奎醚對照品（批號：100931-201101，純度：100%）購自中國食品藥品檢定研究院；鹽酸苯環(huán)壬酯片（北京華素制藥股份有限公司，批號：13082916，規(guī)格：每片2 mg）；乙腈、甲酸為色譜純，水為雙重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（50 mm×3.0 mm，2.7 μm）；流動相：乙腈-0.01%甲酸水溶液（60∶40，V/V），流速：0.4 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10μl。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI 源），正離子方式檢測，采用選擇性多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM）同時測定苯環(huán)壬酯和內(nèi)標(biāo)戊乙奎醚，掃描時間0.2 s。氣簾氣（CUR）：25 psi；霧化器（GS1）：40.0 psi；輔助加熱器（GS2）：55 psi；碰撞氣（CAD）：5.0 psi；離子噴霧電壓（IS）：5 500.00 V，離子源溫度（TEM）：600 。離子去簇電壓（DP）：61 V（苯環(huán)壬酯）、70 V（戊乙奎醚）；入口電壓（EP）：11 V（苯環(huán)壬酯）、10 V（戊乙奎醚）；碰撞能量（CE）：45 eV（苯環(huán)壬酯）、55 eV（戊乙奎醚）；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z358.3→m/z156.1（苯環(huán)壬酯）、m/z316.1→m/z128.1（戊乙奎醚）。

2.3 溶液的制備

2.3.1 鹽酸苯環(huán)壬酯標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取鹽酸苯環(huán)壬酯對照品10 mg，置于100 ml 量瓶中，加乙腈適量，振搖使溶解，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得100μg/ml 的鹽酸苯環(huán)壬酯貯備液。取該貯備液1 ml，置于100 ml 量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，得1μg/ml的鹽酸苯環(huán)壬酯對照品溶液。取上述對照品溶液，以乙腈依次倍比稀釋，制備成質(zhì)量濃度分別為150、100、50、10、5、1 ng/ml 的鹽酸苯環(huán)壬酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取鹽酸戊乙奎醚對照品10 mg，置于100 ml量瓶中，加乙腈適量，振搖使溶解，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得100μg/ml鹽酸戊乙奎醚貯備液。取該貯備液適量，加乙腈倍比稀釋至250 ng/ml，作為內(nèi)標(biāo)溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

2.4 血漿樣品處理

取血漿樣品200 μl，加入20μl內(nèi)標(biāo)溶液（250 ng/ml），渦漩混勻；再加入400 μl 乙腈，渦旋30 s 后，以離心半徑3 cm（下同）、10 000 r/min 離心5 min，取上清液10μl，進行HPLC-MS/MS定量分析。

2.5 方法專屬性考察

分別取鹽酸苯環(huán)壬酯貯備液和鹽酸戊乙奎醚貯備液，首先經(jīng)Q1掃描選擇母離子，然后進行二級質(zhì)譜掃描。根據(jù)質(zhì)譜圖分析結(jié)果，進行MRM 掃描：苯環(huán)壬酯為358.3/156.1（m/z），內(nèi)標(biāo)戊乙奎醚為316.1/128.1（m/z）。取空白血漿、空白血漿+鹽酸苯環(huán)壬酯對照品溶液+內(nèi)標(biāo)溶液、犬給藥后15 min的血漿樣品+內(nèi)標(biāo)溶液，按“2.4”項下方法處理后，進行HPLC-MS/MS法分析。結(jié)果，空白血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)和代謝物不干擾鹽酸苯環(huán)壬酯及內(nèi)標(biāo)的測定，鹽酸苯環(huán)壬酯和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為0.692、0.634 min。MRM色譜圖見圖1。

圖1 MRM色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+鹽酸苯環(huán)壬酯+內(nèi)標(biāo)；C.血漿樣品+內(nèi)標(biāo)；1.內(nèi)標(biāo)；2.鹽酸苯環(huán)壬酯Fig 1 MRM chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+PCH+internal standard；C.plasma sample+internal standard；1.internal standard；2.PCH

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限考察

取空白血漿180 μl，共12份，加入“2.3.1”項下的鹽酸苯環(huán)壬酯標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl，制備成鹽酸苯環(huán)壬酯的質(zhì)量濃度為15.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.1 ng/ml 的質(zhì)控樣品，按“2.4”項下方法處理，每一濃度進行雙樣本分析，進樣10μl，記錄色譜。以鹽酸苯環(huán)壬酯和內(nèi)標(biāo)峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)、鹽酸苯環(huán)壬酯質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重系數(shù)：1/c2）進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.995 3x+0.066 1（r＝0.999 6）。結(jié)果，鹽酸苯環(huán)壬酯檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.1～15.0 ng/ml，定量限為0.1 ng/ml（信噪比為10）。

2.7 回收率與精密度試驗

取空白血漿180 μl，按“2.6”項下方法制備鹽酸苯環(huán)壬酯質(zhì)量濃度分別為12、7、0.3 ng/ml 的質(zhì)控樣品，各5 份，按“2.4”項下方法處理，進樣獲得相應(yīng)色譜峰面積。以其與已知濃度比較計算方法回收率，以其與標(biāo)準(zhǔn)溶液比較計算提取回收率；同一批時間內(nèi)完成血漿樣品處理測定5次考察批內(nèi)精密度，連續(xù)測定3批考察批間精密度?；厥章逝c精密度試驗結(jié)果見表1。

表1 回收率與精密度試驗Tab 1 Results of extraction and precision tests

2.8 血漿樣品穩(wěn)定性考察

?。?0 ℃保存0、7、14、21、28 d的血漿樣品，按“2.4”項下方法處理后，測定其濃度；同法測定反復(fù)冷凍-解凍循環(huán)3次的血漿樣品和處理后再室溫放置0、2、4、8、12、24 h 的血漿樣品。結(jié)果，鹽酸苯環(huán)壬酯血漿樣品在－80 ℃條件下能穩(wěn)定保存28 d（RSD＝7.2%，n＝5）；反復(fù)凍融3 次并不影響血藥濃度測定（RSD＝8.9%，n＝3）；處理后的血漿樣品在室溫條件下能穩(wěn)定保存24 h（RSD＝5.6%，n＝6）。

2.9 基質(zhì)效應(yīng)考察

取空白血漿180μl，共6 份，加入400 μl 乙腈沉淀蛋白后，分別加入鹽酸苯環(huán)壬酯標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，制備成鹽酸苯環(huán)壬酯質(zhì)量濃度為12、7、0.3 ng/ml，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為23 ng/ml的對照血漿，按“2.4”項下方法處理后，進行HPLC-MS/MS 法分析獲得峰面積。以其與相應(yīng)質(zhì)量濃度的鹽酸苯環(huán)壬酯標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的混合溶液直接進樣獲得的峰面積之比評價基質(zhì)效應(yīng)，比值均在90%～110%之間，表明本試驗建立的鹽酸苯環(huán)壬酯測定方法不受基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.10 藥動學(xué)研究

取犬6 只，實驗前1 d 晚8 點開始禁食，實驗當(dāng)天早上8 點分別ig 鹽酸苯環(huán)壬酯片2 mg 和4 mg。給藥后2 h 內(nèi)禁水，給藥4 h 后正常進食進水。給藥和實驗期間盡量避免犬劇烈運動，食物為低脂肪標(biāo)準(zhǔn)餐。于給藥前5 min 和給藥后0.17、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、24、36 h時用肝素化真空采血管取前肢靜脈血2 ml，4 000 r/min離心10 min，按“2.4”項下方法處理后，采用HPLC-MS/MS 法測定鹽酸苯環(huán)壬酯的血藥濃度。2 周后交叉給藥同法測定血藥濃度。利用DAS2.0 軟件按一級吸收二室模型計算藥動學(xué)參數(shù)。犬血漿中鹽酸苯環(huán)壬酯的藥-時曲線見圖2；藥動學(xué)參數(shù)見表2（表中“＊”表示高于定量上限濃度的樣品采用相應(yīng)的空白血漿稀釋后重新測定的濃度）。

圖2 犬血漿中鹽酸苯環(huán)壬酯的藥-時曲線（n＝6）Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of PCH in the plasma of dogs（n＝6）

表2 鹽酸苯環(huán)壬酯片在犬體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab 2 The pharmacokinetic parameters of PCH tablets in dogs（，n＝6）

表2 鹽酸苯環(huán)壬酯片在犬體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab 2 The pharmacokinetic parameters of PCH tablets in dogs（，n＝6）

犬ig 鹽酸苯環(huán)壬酯片劑2 mg 和4 mg 后，藥動學(xué)參數(shù)tmax、t1/2α、t1/2β、MRT0-36h經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明藥物的吸收、分布、消除不受劑量影響；AUC0-36h、cmax經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并與服藥劑量的倍增一致。此結(jié)果與人口服鹽酸苯環(huán)壬酯片劑2 mg和4 mg的研究[7]相符。

3 討論

3.1 流動相的選擇

本實驗中測定的鹽酸苯環(huán)壬酯為外消旋體，因R-鹽酸苯環(huán)壬酯、S-鹽酸苯環(huán)壬酯在有機相比例較低的情況下易于色譜分離，因此采用較高的有機相比例。此時分析物和內(nèi)標(biāo)能達(dá)到色譜分離目的，但分析物峰形拖尾明顯，保留時間較長（＞5 min）。在水相中添加一定比例的甲酸，有利于正離子質(zhì)子化，維持樣品在流動相中的電離狀態(tài)，此時分析物和內(nèi)標(biāo)的峰形得到改善，具有很好的對稱性，且分析時間縮短至0.7 min。最終優(yōu)化確定流動相為乙腈-0.01%甲酸水溶液（60∶40）。

3.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

本文建立的HPLC-MS/MS 法對于內(nèi)標(biāo)與鹽酸苯環(huán)壬酯、與雜質(zhì)的色譜分離要求更高。實驗中曾篩選了硫酸阿托品、硝酸毛果蕓香堿、鹽酸戊乙奎醚等多個內(nèi)標(biāo)候選物[8-9]，綜合保留時間、雜質(zhì)干擾因素，最終選擇鹽酸戊乙奎醚為內(nèi)標(biāo)。

3.3 方法的選擇

在臨床前研究鹽酸苯環(huán)壬酯代謝時，曾采用過放射性同位素分析方法和放射受體分析方法，其給藥劑量分別為1 mg/kg和0.5 mg/kg，檢測靈敏度僅為5 ng/ml[10]。筆者建立了一種靈敏度高、選擇性強的HPLC-MS/MS 法用于Beagle 犬血漿樣品中鹽酸苯環(huán)壬酯的定量分析，方法靈敏度達(dá)到了0.1 ng/ml，滿足鹽酸苯環(huán)壬酯在Beagle犬體內(nèi)藥動學(xué)研究的要求。

本方法采用鹽酸戊乙奎醚為內(nèi)標(biāo)，較之同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物更容易獲得也更價廉，具有可推廣性；采用乙腈直接沉淀蛋白，簡化了實驗步驟，縮短了測定時間，有利于實現(xiàn)大批量樣本的快速分析。筆者應(yīng)用此方法進行了不同給藥劑量的鹽酸苯環(huán)壬酯片口服給藥后Beagle犬體內(nèi)藥動學(xué)研究。在各分析批次樣品中均勻隨機放置高、中、低3 個濃度的質(zhì)控樣品，以此監(jiān)控分析過程的有效性和準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，質(zhì)控合格率為98%。

對于本研究結(jié)果中出現(xiàn)某些藥動學(xué)參數(shù)s大于x的現(xiàn)象，考慮是由于試驗樣本量（n＝6）少、實驗對象存在個體差異造成的。在后期研究過程中，將通過增加樣本量來避免此類問題的出現(xiàn)。

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