五味子提取過程中5-羥甲基糠醛的變化規(guī)律及影響因素研究

李 越，慕升君，李德坤，楊悅武，余伯陽，葉正良，鞠愛春#（.中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，南京 0009；.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，天津 30040）

五味子（Schisandra chinensis）系常用的滋補(bǔ)性中藥，是木蘭科多年生落葉木質(zhì)藤本植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果實(shí)，因其具有甘、酸、辛、苦、咸五味，故名五味子[1-2]，又名五梅子、玄及、會(huì)及、山花椒等[3]。五味子主產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧等地，習(xí)稱“北五味子”，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效，主要用于治療久嗽虛喘、夢(mèng)遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、津傷口渴、短氣脈虛、內(nèi)熱消渴、心悸失眠等癥[1，4]。

5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，簡(jiǎn)稱5-HMF），是由葡萄糖等單糖化合物在高溫或弱酸性等條件下脫水生成的一種具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的醛類化合物，是麥拉德反應(yīng)的典型產(chǎn)物之一[5-7]。目前對(duì)于5-HMF 的藥理作用仍存在爭(zhēng)議，有文獻(xiàn)表述該化合物對(duì)人體內(nèi)臟和橫紋肌有損害[8]，有神經(jīng)毒性，可與人體蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生積蓄中毒，故在2010 年版《中國藥典》（二部）中明確規(guī)定了5-HMF和相關(guān)物質(zhì)在含葡萄糖注射液中的限量[9]。雖然近幾年也有研究表明，5-HMF具有改變血液流變學(xué)、抗心肌缺血、抗氧化等對(duì)人體有益的作用[10-11]，但目前還是將其認(rèn)為是一種在藥材或制劑中應(yīng)控制其限量的化合物。五味子作為常用藥材，其提取方法多為水提醇沉，但由于五味子中含有糖類和酸等成分，在水提醇沉的過程中不可避免地會(huì)產(chǎn)生5-HMF。由于目前對(duì)五味子提取過程中5-HMF含量的監(jiān)控較少，為了更好地控制五味子提取物中5-HMF的含量，筆者對(duì)五味子提取過程中5-HMF 的含量進(jìn)行了監(jiān)控，探明五味子提取過程中5-HMF 的含量變化規(guī)律，并根據(jù)變化規(guī)律中5-HMF含量變化明顯的過程研究其影響因素。

1 材料

1.1 儀器

1100 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AL204 型萬分之一天平、XS105型十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；ZDHW型調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；ALPHA 1-4 LSC型凍干機(jī)（德國Christ 凍干機(jī)有限公司）；真空減壓干燥箱（天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；WK-200B 型高速藥物粉碎機(jī)（青州市精誠機(jī)械有限公司）；KQ5200 型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；L-550型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（長沙湘儀離心儀器有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

五味子藥材（天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地：遼寧，批號(hào)：20121201，經(jīng)中國藥科大學(xué)余伯陽教授鑒定為真品）；5-HMF 對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111626-201308，純度：98.3%）；甲醇、醋酸均為色譜純，水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 五味子提取過程中5-HMF的監(jiān)控

2.1.1 五味子提取過程及取樣點(diǎn)設(shè)置 取五味子藥材（L1）經(jīng)純化水煎煮3次，得三煎合并液（L2）；減壓濃縮得一次濃縮液（L3）；加乙醇調(diào)節(jié)醇度為75%，冷置過濾得一次醇沉液（L4）；減壓濃縮得二次濃縮液（L5）；加乙醇調(diào)節(jié)醇度為85%，冷置過濾得二次醇沉液（L6）；加氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH 為7，冷置過濾得調(diào)堿后濾液（L7）；減壓回收乙醇得三次濃縮液（L8）；L8濃縮液減壓干燥得五味子提取物（L9）。其中L1～L9為取樣點(diǎn)。

2.1.2 供試品溶液的制備（1）測(cè)定五味子藥材（L1）中5-HMF的供試品溶液制備：取五味子藥材粉末（過60目篩）約1.00 g，精密稱定，置于離心管中，加入甲醇12 ml，冰浴超聲（功率為200 W）提取，每次25 min，共提取4 次，離心，過濾，合并提取液，置于50 ml量瓶中，用甲醇加至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。（2）測(cè)定五味子提取過程藥液（L2～L8）中5-HMF的供試品溶液制備：精密量取五味子提取過程藥液適量，用水稀釋定容至適當(dāng)體積，0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。（3）測(cè)定五味子提取物（L9）中5-HMF的供試品溶液制備：精密稱定五味子提取物0.1 g，置于50 ml量瓶中，加水溶解，定容，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取5-HMF對(duì)照品9.03 mg，置于25 ml 量瓶中，用水溶解，定容得0.361 2 mg/ml 的對(duì)照品貯備液；再取1 ml 貯備液定容至25 ml，得0.014 4 mg/ml 的對(duì)照品溶液。

2.1.4 色譜條件及方法學(xué)考察（1）五味子藥材中5-HMF 含量的測(cè)定：色譜柱為Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.5%醋酸水溶液（15∶85），等度洗脫，流速為1 ml/min；檢測(cè)波長為284 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μl；外標(biāo)法定量。經(jīng)方法學(xué)考察，線性回歸方程為y（峰面積）＝55 810x（質(zhì)量濃度）+1.092 1（r＝0.999 9），線性范圍為1.14～18.21 μg/ml；精密度試驗(yàn)測(cè)得5-HMF 峰面積的RSD 為0.21%（n＝5）；穩(wěn)定性試驗(yàn)在10 h 內(nèi)測(cè)得5-HMF 峰面積的RSD 為0.98%（n＝5）；重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)得同一份樣品5-HMF 含量的RSD為1.97%（n＝5）；加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定了3組不同質(zhì)量濃度共9 份樣品，結(jié)果平均加樣回收率為100.06%（RSD＝1.00%，n＝3）。（2）五味子提取過程藥液和提取物中5-HMF測(cè)定色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（5∶95），等度洗脫，流速為1 ml/min；檢測(cè)波長為284 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μl；外標(biāo)法定量。經(jīng)方法學(xué)考察，線性回歸方程為y＝7.1×107x－2 520.1（r＝0.999 9），線性范圍為0.90～36.1 μg/ml；精密度試驗(yàn)測(cè)得5-HMF 峰面積的RSD 為1.67%（n＝5）；穩(wěn)定性試驗(yàn)在10 h 內(nèi)測(cè)得5-HMF 峰面積的RSD 為1.58%（n＝5）；重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)得同一份樣品5-HMF 含量的RSD 為1.81%（n＝5）；加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定了3組不同質(zhì)量濃度的9份樣品，結(jié)果平均加樣回收率為101.61%（RSD＝0.97%，n＝3）。

2.1.5 含量測(cè)定結(jié)果 共提取3批五味子藥材，每個(gè)監(jiān)控點(diǎn)取樣平行測(cè)定3次，5-HMF的含量均折算為生藥中的含量。測(cè)定結(jié)果見表1，含量變化趨勢(shì)見圖1。

表1 3批五味子提取過程中各提取液中5-HMF的含量（g/kg）Tab 1 The contents of 5-HMF in the extracts in the extraction process of 3 batches of Schisandra chinensis（g/kg）

圖1 3批五味子提取過程中5-HMF的含量變化趨勢(shì)圖Fig 1 The content variation trend of 5-HMF in the extraction process of 3 batches of Schisandra chinensis

由表1 和圖1 可以看出，3 批五味子提取過程中5-HMF 的含量變化趨勢(shì)一致：藥材煎煮的過程中均產(chǎn)生大量5-HMF，濃縮時(shí)5-HMF含量均比前一監(jiān)控點(diǎn)升高，醇沉?xí)r5-HMF含量均比前一監(jiān)控點(diǎn)降低，調(diào)堿時(shí)5-HMF的含量基本不變，三次濃縮液（L8）減壓干燥為提取物時(shí)5-HMF的含量明顯下降。

2.2 溫度和時(shí)間對(duì)五味子三次濃縮液（L8）干燥為提取物過程中5-HMF含量的影響

由上述試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五味子三次濃縮液減壓干燥至提取物的過程（見圖1）中5-HMF的含量下降最明顯，為了探明此過程中溫度和時(shí)間對(duì)5-HMF 含量的影響，在不同溫度下減壓干燥五味子三次濃縮液，并在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)定5-HMF的含量；同時(shí)用同一批樣品進(jìn)行冷凍干燥，比較冷凍干燥和減壓干燥所得的五味子提取物中5-HMF含量的差異。

2.2.1 供試品溶液的制備 減壓干燥供試品溶液的制備：分別取400 μl五味子三次濃縮液置于西林瓶中，精密稱定加樣前后西林瓶的質(zhì)量，在設(shè)定的溫度下減壓干燥，待溫度達(dá)到設(shè)定值及真空表讀數(shù)穩(wěn)定后開始計(jì)時(shí)。當(dāng)含水量達(dá)到12%左右時(shí)停止試驗(yàn)，每隔6 h 取1 次樣，將取出的樣品冷卻后用甲醇溶解，定容至10 ml，搖勻，稀釋5 倍后用0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。共設(shè)置5 個(gè)溫度即50、55、60、65、70 ℃，每次試驗(yàn)保持相同的真空度。

冷凍干燥供試品溶液的制備：分別取400 μl稀釋4倍的五味子三次濃縮液置于西林瓶中，精密稱定加樣前后西林瓶的質(zhì)量，凍干。凍干完成后將樣品用甲醇溶解，定容至10 ml，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 同“2.1.3”項(xiàng)下方法。

2.2.3 色譜條件 同“2.1.4”中五味子提取過程藥液和提取物中5-HMF測(cè)定色譜條件。

2.2.4 5-HMF 含量測(cè)定結(jié)果 5-HMF 的含量以5-HMF 占樣品干質(zhì)量的含量計(jì)算。經(jīng)水分測(cè)定得知五味子三次濃縮液干質(zhì)量百分比為19.4%。五味子三次濃縮液在不同溫度下減壓干燥不同時(shí)間、凍干后5-HMF 的含量測(cè)定結(jié)果見表2，不同溫度下減壓干燥不同時(shí)間5-HMF含量變化見圖2。

表2 五味子三次濃縮液在不同溫度下減壓干燥不同時(shí)間、凍干后5-HMF的含量（n＝3，mg/g）Tab 2 The contents of 5-HMF in S.chinensis extracts by 3 times of concentrate at different time points after vacuum drying at different temperatures and after freeze-drying（n＝3，mg/g）

圖2 五味子三次濃縮液在不同溫度下減壓干燥不同時(shí)間后5-HMF的含量變化Fig 2 The content variation of 5-HMF in S.chinensis extracts by 3 times of concentrate at different time points after vacuum drying at different temperatures

由表2 和圖2 可以看出，真空度一定時(shí)，在相同溫度下減壓干燥，5-HMF的含量隨減壓干燥時(shí)間延長而逐漸下降；干燥相同時(shí)間時(shí)，5-HMF的含量隨溫度升高而降低；減壓干燥至含水量接近時(shí)，隨溫度的升高，5-HMF 的含量降低，減壓干燥所需時(shí)間縮短；冷凍干燥五味子提取液對(duì)5-HMF 含量的降低程度明顯低于減壓干燥法。

3 討論

本試驗(yàn)中五味子藥材、提取液及提取物中5-HMF 的含量測(cè)定所用的檢測(cè)方法均經(jīng)筆者試驗(yàn)得出，且經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證。由于5-HMF主要是由葡萄糖等單糖化合物在高溫或弱酸性等條件下產(chǎn)生，溫度對(duì)5-HMF的含量影響較大，故為了測(cè)定五味子藥材中5-HMF 含量的真實(shí)值，避免加熱提取的影響而采用了甲醇冰浴超聲提??；但是在生產(chǎn)過程中通常采用水提醇沉的方法提取，所以藥材和提取液（物）中物質(zhì)基礎(chǔ)可能有所不同。因此在本文中測(cè)定不同樣品中的5-HMF含量時(shí)采用了不同的色譜條件。

分析五味子提取過程中5-HMF 含量變化趨勢(shì)的原因：由文獻(xiàn)[5-6，10]可知，影響5-HMF生成的主要因素有糖、溫度和pH，且5-HMF 性質(zhì)不穩(wěn)定，可以發(fā)生聚合或分解反應(yīng)。另外筆者經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，5-HMF可隨水分蒸發(fā)或升華：通過旋蒸五味子三次濃縮液，檢測(cè)蒸出液，發(fā)現(xiàn)其中含有5-HMF，表明5-HMF 會(huì)隨水分蒸發(fā)；通過對(duì)五味子提取物的減壓升華試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)升華物中含有少量5-HMF，表明5-HMF 可以升華。五味子在煎煮和濃縮過程中5-HMF的含量增加是因?yàn)榧逯蠛蜐饪s時(shí)溫度較高，且五味子中含有較多的有機(jī)酸[12]，pH 為酸性，利于5-HMF 的生成，此時(shí)5-HMF 的生成量遠(yuǎn)大于隨水分蒸發(fā)、升華等的去除量。醇沉?xí)r5-HMF 含量降低是因?yàn)榇藭r(shí)溫度較低，不利于產(chǎn)生5-HMF，而部分5-HMF此時(shí)會(huì)被包埋在沉淀物中而除去。加堿調(diào)節(jié)pH為中性時(shí)，5-HMF的含量變化不大，這是因?yàn)檎{(diào)堿的中性環(huán)境不具備糖類產(chǎn)生5-HMF的條件，且在此過程中不存在5-HMF 因蒸發(fā)、升華等被除去的現(xiàn)象。減壓干燥后的提取物中5-HMF 的含量明顯降低，是由于減壓干燥的過程中pH 為中性，5-HMF 的生成較少，而溫度較高，5-HMF隨水分蒸發(fā)、升華等去除較多。

減壓干燥所用樣品為3批五味子三次濃縮液的合并液，合并后攪拌均勻，每次用完后冷凍保存，下次試驗(yàn)時(shí)，放至室溫融化，分裝于西林瓶中進(jìn)行相應(yīng)試驗(yàn)；冷凍干燥所用樣品為減壓干燥所用五味子三次濃縮液的稀釋液。所有樣品均來源于同一批五味子的三次濃縮液，避免了不同樣品引起的干擾。

五味子三次濃縮液減壓干燥時(shí)5-HMF的含量隨溫度的升高和干燥時(shí)間的延長而降低，這可能是由于干燥過程中pH為中性，不利于產(chǎn)生5-HMF，而5-HMF 會(huì)因隨水分蒸發(fā)、升華等除去，溫度的升高和干燥時(shí)間的延長利于5-HMF 發(fā)生這些反應(yīng)。冷凍干燥對(duì)5-HMF 含量的降低效果不如減壓干燥，可能是因?yàn)閮龈蓵r(shí)溫度較低，不利于5-HMF的去除。

減壓干燥時(shí)由于不同溫度及不同時(shí)間點(diǎn)的樣品含水量不同，為了準(zhǔn)確比較其中5-HMF 的含量，應(yīng)先測(cè)定樣品的水分，最后折合成干質(zhì)量進(jìn)行分析比較。每個(gè)取樣點(diǎn)取3 份樣品平行測(cè)定，5-HMF 含量的RSD 均在2.0%以內(nèi)，表明結(jié)果重復(fù)性好，具有代表性。

上述試驗(yàn)結(jié)果提示，可以適當(dāng)采用較高的溫度減壓干燥五味子三次濃縮液，從而得到5-HMF 含量更低的五味子提取物，進(jìn)而提高五味子提取物的質(zhì)量。本次試驗(yàn)中70 ℃減壓干燥五味子三次濃縮液時(shí)5-HMF含量最低，但是考慮到70 ℃溫度過高會(huì)導(dǎo)致提取物產(chǎn)生糊味，所以筆者認(rèn)為65 Ⅹ減壓干燥效果最好。

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