正交試驗法優(yōu)選復(fù)方苦黃方的水提取工藝Δ

張 哲，李明春，石永堅，趙麗艷，程艷芹（解放軍第401醫(yī)院，山東青島 266071）

復(fù)方苦黃方是解放軍第401 醫(yī)院治療濕疹的純中藥外用方劑，由苦參、黃柏、蛇床子、防風(fēng)、蒼術(shù)等組成，具有祛風(fēng)勝濕、清熱燥濕、解毒止癢之功效。由其制成的洗劑在我院臨床使用多年，療效確切。但由于患者反映該制劑使用及運輸保存均不方便，筆者對其進行了再次開發(fā)研究，擬將其開發(fā)成方便患者使用及保存的凝膠劑。為了最大限度地提取出有效成分，首先對其提取工藝進行優(yōu)選。筆者在本試驗中將方中蛇床子、防風(fēng)、蒼術(shù)等經(jīng)超臨界二氧化碳（SFE-CO2）萃取后的藥渣與處方量的苦參、黃柏藥材相混合，用正交試驗設(shè)計法，以苦參中的苦參堿與氧化苦參堿含量之和、防風(fēng)中的升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷含量之和、黃柏中的鹽酸小檗堿含量以及浸膏得率為指標(biāo)，綜合評價，優(yōu)選復(fù)方苦黃方的水提取工藝條件，以保證制劑的臨床療效。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；LC-10A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KH-100B 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；80-1型離心沉淀機（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）；DV215CD 型電子分析天平（美國奧豪斯公司）。

1.2 藥材

苦參（批號：070129），為豆科植物苦參Sophora flavescensAit.的干燥根；黃柏（批號：070801），為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinenseSchneid.的干燥樹皮；防風(fēng)（批號：0105200113），為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk的干燥根；蛇床子（批號：20110506），為傘形科植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss 的干燥成熟果實；蒼術(shù)（批號：001054508），為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea（Thunb.）DC.的干燥根莖。以上品種均購自同仁堂藥業(yè)有限公司青島分公司，由山東中醫(yī)藥大學(xué)張華副教授鑒定為真品。

1.3 藥品與試劑

苦參堿對照品（批號：110805-200507，供含量測定用）、氧化苦參堿對照品（批號：110780-201007，純度：92.3%）、升麻素苷對照品（批號：111522-201008，純度：93.9%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品（批號：111523-201007，純度：96.5%）、鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-200910，純度：97.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；液相色譜分析用甲醇、乙腈、無水乙醇均為色譜純；液相色譜用水為高純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗設(shè)計

參照復(fù)方苦黃方臨床使用情況以及中藥湯劑煎煮常規(guī)方法，為保證試驗的可比性和可重復(fù)性，在飲片規(guī)格、提取次數(shù)、濾過、濃縮等條件相同的前提下，經(jīng)過查閱文獻[1]以及預(yù)試驗，選擇對提取結(jié)果影響明顯的3 個因素即提取時間（A）、加水量（B）以及浸泡時間（C）為考察因素，采用L9（34）正交試驗設(shè)計表安排正交試驗。因素與水平見表1。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

2.2 樣品液的制備

準(zhǔn)確稱量處方量苦參、黃柏藥材，共9份，加入其他處方量按相同條件的SFE-CO2法萃取后的藥渣，混合均勻后，依照表1及正交試驗設(shè)計表進行試驗?；亓魈崛?次，濾過，合并3次提取液，濃縮定容至600 ml，制得1～9號樣品液。

2.3 苦參堿和氧化苦參堿的含量測定[2-5]

2.3.1 色譜條件 色譜柱：依利特Hypersil APS-2（NH2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-無水乙醇-3%磷酸（80∶10∶10），流速：1 ml/min；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。

2.3.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取苦參堿對照品和氧化苦參堿對照品，分別加乙腈-無水乙醇（80∶20）混合溶液溶解、定容，制成質(zhì)量濃度為1.976 mg/ml的苦參堿對照品貯備液和1.524 mg/ml的氧化苦參堿對照品貯備液。分別取2種對照品貯備液適量，置于同一量瓶中，用乙腈-無水乙醇（80∶20）混合溶液分別稀釋定容成含苦參堿29.64、88.92、148.20、207.48、266.76、326.04 μg/ml 和含氧化苦參堿22.86、68.58、114.30、160.02、205.74、251.46 μg/ml的1～6號混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 分別精密量取“2.2”項下1～9 號樣品液各20 ml，離心（3 000 r/min，離心半徑5 cm）25 min；取上清液，用氨試液調(diào)pH至10，置于分液漏斗中，用三氯甲烷萃取5 次，每次20 ml；合并三氯甲烷液，置于60 ℃水浴上揮干；用適量無水乙醇溶解殘渣，并轉(zhuǎn)移至25 ml 量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，混勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得1～9號供試品溶液。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 稱取除苦參外的其余處方量藥材，照“2.2”和“2.3.3”項下方法，依法制得陰性對照溶液。

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗 分別吸取陰性對照溶液、4號混合對照品溶液、1號供試品溶液各20 μl，注入液相色譜儀，按“2.3.1”項下色譜條件測定。結(jié)果顯示，供試品色譜中，苦參堿保留時間為9 min 左右，氧化苦參堿保留時間為13 min 左右，均與對照品的保留時間一致；主成分峰與雜質(zhì)峰分離度＞2.0，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 苦參堿和氧化苦參堿高效液相色譜圖A.陰性對照溶液；B.混合對照品溶液；C.供試品溶液；1.苦參堿；2.氧化苦參堿Fig 1 HPLC chromatograms of matrine and oxymatrineA.negative control solution；B.mixed reference substance solution；C.test sample solution；1.matrine；2.oxymatrine

2.3.6 線性關(guān)系考察 吸取“2.3.2”項下1～6號混合對照品溶液各20 μl，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以峰面積值（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得苦參堿回歸方程為y＝512.0x+10.12（r＝0.999 9，n＝6），氧化苦參堿回歸方程為y＝536.3x+1.070（r＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果表明，苦參堿和氧化苦參堿的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為29.64～326.04、22.86～251.46 μg/ml。

2.3.7 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗 按相關(guān)要求分別進行試驗。結(jié)果，精密度試驗中苦參堿和氧化苦參堿峰面積的RSD 分別為0.15%、0.22%（n＝6）；重復(fù)性試驗中苦參堿和氧化苦參堿峰面積的RSD 分別為1.06%、1.73%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗中樣品液放置12 h 苦參堿和氧化苦參堿含量的RSD 分別為1.32%、1.10%（n＝6）；加樣回收率試驗中苦參堿和氧化苦參堿回收率分別為100.98%、98.61%，RSD分別為1.52%、1.25%（n＝6）。以上表明含量測定方法符合規(guī)定。

2.4 升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水，梯度洗脫（0 min，乙腈13%、水87%；20 min，乙腈30%、水70%）；流速：1 ml/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

2.4.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥后的升麻素苷對照品和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，加甲醇溶解，定容，制成質(zhì)量濃度為471.2 μg/ml 的升麻素苷和519.6 μg/ml的5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品溶液。分別精密移取以上2 種對照品溶液適量，用甲醇稀釋定容，制成升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷質(zhì)量濃度分別為7.5、15 μg/ml的混合對照品溶液。2.4.3 供試品溶液的制備 精密量取“2.2”項下1～9 號樣品液各1 ml，通過中性氧化鋁柱（100～200目，2 g，內(nèi)徑1 cm），用甲醇50 ml洗脫，收集甲醇洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得1～9號供試品溶液。

2.4.4 樣品中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量測定 取“2.4.2”項下的混合對照品溶液及“2.4.3”項下的1～9號供試品溶液，在“2.4.1”項色譜條件下，分別進樣10 μl，記錄峰面積，計算升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷含量之和。

經(jīng)方法學(xué)考察，測定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量的方法學(xué)符合要求，其具體內(nèi)容另文發(fā)表[6]。

2.5 鹽酸小檗堿的含量測定[7-10]

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Agilent SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（每1 000 ml水中加入0.05 mol磷酸二氫鉀并用磷酸調(diào)pH 至2.5）（25∶75），流速：1 ml/min；檢測波長：265 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

2.5.2 對照品溶液的制備 取經(jīng)五氧化二磷干燥后的鹽酸小檗堿對照品，精密稱定，加流動相溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為1.997 mg/ml的鹽酸小檗堿對照品貯備液。移取對照品貯備液適量，再用流動相稀釋定容，分別制成質(zhì)量濃度為39.94、79.88、119.8、159.7、199.7 μg/ml的1～5號對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液制備 精密量取“2.2”項下的1～9 號樣品溶液各2 ml，置于10 ml量瓶中，加入適量1%鹽酸甲醇溶液超聲10 min，放冷，用1%鹽酸甲醇溶液定容至10 ml，離心（3 000 r/min，離心半徑5 cm），取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得1～9號供試品溶液。

2.5.4 陰性對照溶液的制備 稱取除黃柏外其余處方量藥材，按照“2.2”項下1 號樣品液處理方法和“2.5.3”項下供試品溶液制備方法，依法制得陰性對照溶液。

2.5.5 系統(tǒng)適用性試驗 取陰性對照溶液、4號對照品溶液、1號供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按“2.5.1”項下色譜條件測定。結(jié)果顯示，供試品色譜中，鹽酸小檗堿保留時間在10 min 左右，與對照品的保留時間一致；主成分峰與雜質(zhì)峰分離度＞2.0，陰性對照無干擾。色譜圖見圖2。

2.5.6 線性關(guān)系考察 吸取“2.5.2”項下1～5號對照品溶液各10 μl，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得鹽酸小檗堿回歸方程為y＝23.23x－4.755（r＝0.999 9，n＝5）；結(jié)果表明，鹽酸小檗堿檢測質(zhì)量濃度線性范圍為39.94～199.7 μg/ml。

2.5.7 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗 按相關(guān)要求分別進行試驗。結(jié)果，精密度試驗中峰面積的RSD 為0.09%（n＝6）；重復(fù)性試驗中峰面積的RSD 為1.72%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗中樣品溶液放置24 h 含量的RSD 為0.24%（n＝6）；加樣回收率試驗平均值為98.6%，RSD 為0.99%（n＝6）。以上表明含量測定方法符合規(guī)定。

2.6 浸膏得率的測定

精密吸取“2.2”項下1～9 號樣品液各10 ml，按2010 年版《中國藥典》（一部）“浸出物測定法”（附錄ⅩA）項下方法[11]，置于已烘干至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘3 h，計算浸膏得率[（浸膏量/10）×（總藥液量/藥材量）×100%]。

圖2 鹽酸小檗堿高效液相色譜圖A.陰性對照溶液；B.對照品溶液；C.供試品溶液；1.鹽酸小檗堿Fig 2 HPLC chromatograms of berberine hydrochlorideA.negative control solution；B.reference substance solution；C.test sample solution；1.berberine hydrochloride

2.7 正交試驗結(jié)果及方差分析[12]

取“2.2”項下1～9號樣品液，分別測定提取液中苦參堿和氧化苦參堿含量之和（Y1）、升麻素苷含量和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量之和（Y2）、鹽酸小檗堿的含量（Y3），同時計算浸膏得率（Y4）。根據(jù)4項指標(biāo)對提取方法的影響程度，分別給予權(quán)重系數(shù)0.3、0.3、0.3、0.1。將所得數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進行綜合評價{Y＝[（Y1/Y1max）×0.3+（Y2/Y2max）×0.3+（Y3/Y3max）×0.3+（Y4/Y4max）×0.1]×100}。正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 2 Design and results of orthogonal test

方差分析結(jié)果表明，提取時間（A）對綜合評價值具有顯著性影響（P＜0.05）；極差分析結(jié)果表明，各因素對綜合評價值影響的先后次序為提取時間（A）＞加水量（B）＞浸泡時間（C），各因素水平的強弱順序為A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C2＞C1＞C3。結(jié)合操作實際和節(jié)約能源的需要，確定優(yōu)選的工藝參數(shù)組合為A3B1C1，即提取時間120 min，加水量8、6、6 倍（以投料的藥材和藥渣總質(zhì)量計），浸泡時間20 min。

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

2.8 工藝驗證

取處方量苦參、黃柏藥材，共3份，分別加入其余處方量的按相同條件的SFE-CO2法萃取后的蛇床子、防風(fēng)、蒼術(shù)藥渣，混合均勻后，加水浸泡20 min，回流提取3次，加水量分別為8、6、6 倍，每次提取120 min，按照“2.2”項下樣品液的制備方法制備3 批樣品，分別測定。結(jié)果，3 批樣品苦參堿和氧化苦參堿的總含量平均值為3.152 6 mg/g，RSD為1.03%（n＝3），升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的總含量平均值為4.977 2 mg/g，RSD為2.27%（n＝3）；鹽酸小檗堿的平均含量為3.345 0 mg/g，RSD 為1.19%（n＝3）；浸膏得率平均值為49.23%，RSD 為2.43%（n＝3）。以上表明由正交試驗篩選出來的水提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

預(yù)試驗曾考察藥材吸水率、加水量、浸泡時間、提取時間、提取次數(shù)對苦參堿與氧化苦參堿的總量、升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷的總量、鹽酸小檗堿的含量和浸膏得率的影響，最終選取對提取效果影響相對較大的3個因素：加水量、浸泡時間、提取時間為考察因素。驗證試驗結(jié)果表明，本正交試驗所優(yōu)選的水提取工藝穩(wěn)定可行。

在苦參堿與氧化苦參堿的色譜分析中，曾使用甲醇、無水乙醇為供試液的溶劑，使用不同比例的甲醇-水、乙腈-水、乙腈-無水乙醇、乙腈-無水乙醇-3%磷酸為流動相。經(jīng)過比較，結(jié)果以無水乙醇為供試品溶劑，2010 年版《中國藥典》（一部）“苦參”含量測定項下[11]流動相條件中的乙腈-無水乙醇-3%磷酸（80∶10∶10）為流動相時，樣品峰形對稱、與其他雜質(zhì)峰分離度良好。

在鹽酸小檗堿的含量測定中，曾參考2010 年版《中國藥典》（一部）中“黃柏”含量測定項下的方法進行檢測，但分離效果不好。筆者分析可能是由于本制劑屬于復(fù)方制劑，其干擾成分與單味黃柏有很大差別所致。筆者在試驗中發(fā)現(xiàn)，由于黃柏中既含鹽酸小檗堿又含小檗堿，在用1%鹽酸甲醇溶液定容時，先超聲10 min，使小檗堿均轉(zhuǎn)化成鹽酸小檗堿，更便于含量測定。在選擇測定波長時，取鹽酸小檗堿對照品溶液在200～400 nm波長處掃描，顯示鹽酸小檗堿在265、346 nm波長處均有較大吸收峰，但在265 nm 波長處雜質(zhì)峰干擾較少。因此，本試驗選擇265 nm為檢測波長。在流動相的選擇時，在水相為純水的條件下，樣品峰之間分離度不好，而且會出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象。當(dāng)在水相中加入適量的磷酸二氫鉀制備成0.05 mol/L的緩沖鹽溶液并調(diào)節(jié)pH為2.5后，各峰之間的分離度均在1.5以上，達到了分離要求。

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