白樺木質(zhì)部蛋白提取方法的建立1)

孫丹 王玉成 王超

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

責(zé)任編輯:潘 華。

蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與生物體內(nèi)幾乎所有的生命活動(dòng)過程［1］，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已成為林木材性研究的重要技術(shù)手段［2］。而雙向電泳是研究蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用最廣泛的分離技術(shù)，該技術(shù)最關(guān)鍵的步驟是蛋白質(zhì)樣品的制備［1］。如今林木蛋白質(zhì)組學(xué)的研究起步較晚，進(jìn)展緩慢，主要是因?yàn)榱帜窘M織含有較高的酚醛、樹脂和單寧酸并且蛋白樣品制備困難［3］。蛋白質(zhì)的提取效果的好壞直接影響蛋白質(zhì)的分離及后續(xù)試驗(yàn)的可靠性，所以蛋白質(zhì)的提取成為研究關(guān)鍵［4］。

白樺(Betula platyphylla Suks.)是一個(gè)北溫帶的廣布種，其基本密度、木材硬度、白度、纖維形態(tài)、化學(xué)組分以及打漿性能均符合造紙用材的要求［5］，是優(yōu)良的短周期闊葉紙漿用材樹種。對(duì)其木材形成的分子生物學(xué)研究已經(jīng)成為木本植物研究的重要內(nèi)容之一，其中利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究其木質(zhì)部發(fā)育的調(diào)控成為重要手段。如今對(duì)白樺蛋白的研究主要集中在花芽上［6－7］，對(duì)木質(zhì)部蛋白的提取未見報(bào)道，而白樺的組織中存在大量的糖類、酚類等活性成分［8］，使蛋白提取的難度增大，所以建立一種適用于白樺木質(zhì)部蛋白提取的方法具有重要理論與應(yīng)用價(jià)值。

目前提取植物蛋白的方法有很多［4］，其中TCA—丙酮法是最為常用的一種方法，在小麥葉片總蛋白的提?。?］，毛白楊芽蛋白的提?。?0］，楊樹樹皮蛋白的提?。?］，楊樹樹葉蛋白的提取［3］中均取得較好的效果，但是該方法的提取體系較大，需要大量的初始材料，對(duì)設(shè)備要求較高，在有限的材料的情況下，我們需要建立一種高效簡便的方法。

本研究比較分析了TCA—丙酮法、酚提取法、試劑盒提取法3 種方法提取白樺木質(zhì)部蛋白的提取效率和提取質(zhì)量，并對(duì)酚提取法加以改良，建立了一個(gè)經(jīng)濟(jì)，實(shí)用，高效，優(yōu)質(zhì)的白樺木質(zhì)部蛋白提取方法。為今后的蛋白質(zhì)組學(xué)分析和利用分子生物學(xué)手段改良白樺材性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

于2011年8月，采集白樺(Betula platyphylla Suks.)4年生實(shí)生苗莖干，剝?nèi)ネ鈱訕淦?，削取外?～5 mm 正在發(fā)育的木質(zhì)部，液氮速凍，置于冰箱中－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1 蛋白提取方法

取約2 g 凍存材料，用液氮充分研磨之后，平均分成3 份，每份0.6 g，分別用于3 種提取方法。

TCA—丙酮法:取0.6 g 用液氮充分研磨的材料，將粉末轉(zhuǎn)移到50 mL 離心管中并加入3 倍體積的－20 ℃預(yù)冷的丙酮溶液(含10% TCA 和0.1%DTT)，－20 ℃沉淀過夜。4 ℃，35 000 g 離心1 h，棄上清，保留沉淀。用3 倍于沉淀體積的含有0.07%的β—巰基乙醇的預(yù)冷丙酮沉淀重懸，－20 ℃沉淀1 h。4 ℃，100 000 g 離心1 h，棄上清，保留沉淀。上述步驟重復(fù)一次。用真空干燥離心機(jī)將沉淀抽干，置于－80 ℃待用。

酚提取法:取0.6 g 用液氮充分研磨的材料，分裝于1.5 mL 離心管中，每管加入1 mL 的勻漿緩沖液(20 mmol/L Tris－HCl(pH=7.5)，0.9 mol/L sucrose，10 mmol/L EGTA，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT 以及1% Triton X－100)，震蕩20 min。4 ℃，14 000 r/min 離心60 min。取上清液，加入等體積的pH=7.8 Tris—飽和酚，震蕩5 min，12 000 r/min，4 ℃下離心30 min。取酚層，加入5 倍體積含0.1 mol/L 乙酸銨的預(yù)冷甲醇，充分混勻，－20 ℃下過夜，沉淀蛋白。沉淀用含0.1 mol/L 乙酸銨的預(yù)冷甲醇洗2 次。預(yù)冷丙酮洗2 次。所得蛋白干粉置于－80 ℃待用。

試劑盒提取法:采用上海生工的植物蛋白提取試劑盒(Plant Total Protein Extraction Kit)。取0.6 g用液氮充分研磨的材料，將粉末轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中。每100 mg 組織粉末加入1 mL Solution A 和0.7 μL Solution C 粉末懸浮后，置－20 ℃，45 min。16 000 r/min，4 ℃，離心15 min，取沉淀。往沉淀中加入1 mL Solution B，10 μL Solution D，0.7 μL Solution D，0.7 μL Solution C，并將沉淀懸浮后，立即16 000 r/min，4 ℃，離心15 min。取沉淀進(jìn)行冷凍干燥，置于－80 ℃待用。

1.2 蛋白質(zhì)樣品溶解

將蛋白質(zhì)加入裂解液(含7 mol·L－1尿素，2 mol·L－1硫脲，4% Chaps，1% DTT，10 mmol·L－1EGTA，10 mmol·L－1PMSF)，充分浸泡，于37 ℃搖床震蕩60 min。4 ℃，14 000 r/min，離心60 min，去沉淀，保留上清液。采用2－D Quant Kit 試劑盒(GE 公司)測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定樣品吸光度值，計(jì)算樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3 蛋白質(zhì)樣品純化與濃度測定

將裂解的蛋白質(zhì)用5 倍體積的丙酮重沉，于－20 ℃沉淀24 h，4 ℃，14 000 r/min 離心60 min，棄上清。按照1.2 的方法重新進(jìn)行裂解。采用2－D Quant Kit 試劑盒(GE 公司)測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定樣品吸光度值，計(jì)算樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.4 SDS-PAGE 凝膠電泳與凝膠掃描

使用不連續(xù)膠SDS－PAGE 法［11］，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%，每孔上樣量約為8 μL，與2×Loading buffer 等體積混勻后上樣。采用Bio－Rad 公司的PowerPac basic 垂直電泳系統(tǒng)。電泳條件為80 V 約3 h，120 V 約1 h。電泳結(jié)束后考馬斯亮藍(lán)R 染色。染色后用Image Scanner Ⅲ掃描儀(GE Healthcare)對(duì)凝膠進(jìn)行掃描和圖像采集。

1.5 雙向電泳與凝膠掃描

第1 向采用13 cm，pH 值3～10，NL 的IPG 膠條，蛋白上樣的質(zhì)量為150 μg，上樣總體積為200 μL，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，使所有樣品蛋白上樣總質(zhì)量保持一致，不足的體積用水化液(8 mol/L 尿素，2% CHAPS，40 mmol/L DTT，2% pH 值3～10 IPG Buffer，0.002%溴酚藍(lán)。)補(bǔ)齊。等電聚焦程序?yàn)?50 V，17 h;500 V，2 h;1 000 V，1 h;8 000 V，2 h;8 000 V，3.5 h，整個(gè)過程在20 ℃下進(jìn)行。等電聚焦結(jié)束后，取出膠條，放入含有0.05 g DTT 的平衡液(50 mmol/L Tris－HCl，6 mol/L 尿 素，30%甘 油，2%SDS，0.002%溴酚藍(lán)中，將平衡管置于搖床上平衡30 min。第1 步平衡結(jié)束后，將膠條放入含有0.125 g 碘乙酰胺的平衡液中，將平衡管置于搖床上平衡30 min。將平衡好的膠條轉(zhuǎn)移到14%聚丙烯酰胺凝膠上，進(jìn)行第2 向電泳分離，條件為:40 mA 約40 min，70 mA 約1.5 h，至溴酚藍(lán)跑到膠底部，采用銀染法(Silver Steining Kit，GE 公司)對(duì)電泳膠進(jìn)行染色。染色后用Image Scanner Ⅲ掃描儀(GE Healthcare)對(duì)凝膠進(jìn)行掃描和圖像采集。利用專業(yè)2D 膠分析軟件PDQuest8.01 進(jìn)行雙向電泳的圖像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取的蛋白質(zhì)得率比較

由表1中可以看出，3 種方法提取的蛋白濃度差異較大。酚法提取的蛋白質(zhì)量濃度最大，其蛋白質(zhì)量濃度是TCA—丙酮法的15 倍，試劑盒提取法的4 倍。TCA—丙酮法提取的蛋白質(zhì)量濃度最低，試劑盒法提取的蛋白質(zhì)量濃度是TCA—丙酮法的6倍。而TCA—丙酮法得到的蛋白溶液體積是其他兩種方法的2 倍，但是最終酚法得到的蛋白總質(zhì)量最多，是TCA—丙酮法的7 倍多，是試劑盒法的4 倍多。

2.2 不同提取方法的1－DE 圖譜分析

由圖1的結(jié)果中可以看出，相同的上樣體積，酚法提取的蛋白質(zhì)量濃度最大，符合上述蛋白質(zhì)量濃度的測定結(jié)果。1－DE 圖譜結(jié)果顯示，3 種方法提取的蛋白條帶清晰，且分離性較好，沒有出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。在高分子量區(qū)域(＞100 kD)和低分子量區(qū)域(＜25 kD)都可以檢測到明顯的蛋白條帶。而TCA—丙酮法在a 區(qū)域能檢測到的蛋白條帶明顯少于其他2 種方法，酚法和試劑盒法的蛋白條帶圖譜很相似，在a 區(qū)域均顯示出豐富的蛋白條帶，但是個(gè)別條帶在豐度上出現(xiàn)差異(圖1箭頭所指)。

表1 3 種方法提取的蛋白量

2.3 不同提取方法的2－DE 圖譜分析

用TCA—丙酮法、酚法、試劑盒提取法分別提取白樺木質(zhì)部蛋白，通過蛋白質(zhì)裂解，經(jīng)雙向電泳及染色，通過圖像采集系統(tǒng)得到的電泳圖譜如圖2所示。從2－DE 圖譜中可以看出3 種方法的蛋白質(zhì)點(diǎn)均比較清晰，呈圓形或橢圓形。蛋白質(zhì)點(diǎn)多集中在pH 值為4～7 內(nèi)，分子量在95～10 kD，在高分子量區(qū)域(＞100 kD)和低分子量區(qū)域(＜25 kD)的蛋白質(zhì)點(diǎn)較少，高豐度蛋白質(zhì)集中的區(qū)域與1－DE 蛋白條帶豐富區(qū)相符合。其中酚法的凝膠背景干凈，蛋白質(zhì)點(diǎn)更清晰，拖尾現(xiàn)象較少，鑒定的蛋白質(zhì)點(diǎn)最多，如圖2所示。電泳圖譜經(jīng)PDQuest8.01 進(jìn)行分析，酚提取法得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)最多，為398 個(gè)，匹配率100%;TCA—丙酮法為270 個(gè)，匹配率68%;試劑盒法為284 個(gè)，匹配率71%。

圖1 3 種方法提取白樺木質(zhì)部蛋白的1－DE 圖譜

圖2 3 種方法提取白樺木質(zhì)部蛋白的2－DE 圖譜

3 結(jié)論與討論

蛋白提取技術(shù)一直是植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的關(guān)鍵技術(shù)［12］，不同的植物組織結(jié)構(gòu)及成分不同，適用的蛋白提取方法也不相同［13］。白樺木質(zhì)部中本身蛋白含量較少并且存在大量的糖類和活性成分，增加了提取的難度。在個(gè)別研究中，進(jìn)行蛋白質(zhì)提取的樣品量有限，較高的提取效率就更為重要。為了能夠建立一種適用于白樺木質(zhì)部蛋白的提取方法，本研究嚴(yán)格地控制初始材料的質(zhì)量，先將材料進(jìn)行充分研磨，之后進(jìn)行均分，得到3 份質(zhì)量為0.6 g的材料，再分別用TCA—丙酮法、酚提取法、試劑盒提取法進(jìn)行提取，這樣可以更直觀地看出這3 種方法的優(yōu)劣。結(jié)果顯示，相同質(zhì)量的材料提取的蛋白質(zhì)濃度差異較大，獲得蛋白質(zhì)的最終質(zhì)量也不相同，即在有限的材料的前提下，3 種方法的提取效率不同。

試劑盒法，操作簡單，提取的蛋白質(zhì)量濃度適中，而且從2－DE 結(jié)果中得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)較多，但是因?yàn)楸狙芯康脑囼?yàn)材料為木質(zhì)部，不易研磨，一旦提取材料的質(zhì)量加大，則操作不易，藥品的耗損加大，而且最終得到的蛋白沉淀不易裂解，所以最終得到的蛋白質(zhì)質(zhì)量不高。并且一個(gè)試劑盒每100 mg 提取50 次，提取數(shù)量有限，增加了試驗(yàn)成本，不適合于大量蛋白提取的研究。

TCA—丙酮法是提取植物蛋白最常用的方法，操作步驟簡單，蛋白粗提物產(chǎn)量大［4］，本研究中經(jīng)過純化，TCA—丙酮法得到的蛋白質(zhì)體積仍是其他方法的2 倍。但是該方法實(shí)驗(yàn)過程耗時(shí)較長，需要使用超速離心設(shè)備，而且不能有效地去除材料組織中的多糖［14］，進(jìn)而影響了蛋白質(zhì)樣品的上樣量和電泳的質(zhì)量。而且在繁瑣的提取過程中也加大了蛋白質(zhì)的損失量，從圖1中可以看出TCA—丙酮法并沒有有效地消除可能影響蛋白質(zhì)量的干擾物，在a 區(qū)域的蛋白質(zhì)條帶也沒有其他2 種方法提取的豐富。從圖2中可以看出橫縱條紋較多，得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)沒有其他2 種方法的清晰。并且，提取相同質(zhì)量材料的蛋白，TCA—丙酮法得到的蛋白濃度最低，盡管提取材料較少不適合該方法的大體系提取，但與其他兩種方法比較，TCA—丙酮法的提取效率最低。

酚是一種溫和的變性劑，而多糖類物質(zhì)不溶于酚相，蛋白質(zhì)更容易進(jìn)入酚層，這樣可有效去除樣品中的雜質(zhì)［4］，提高蛋白的提取效率。傳統(tǒng)的酚提取法［4］是將材料研磨之后，在研缽中加入提取緩沖液，而本研究將材料分裝到1.5 mL 離心管再加入緩沖液，震蕩20 min，這樣能更有效的減少材料的損失，也使材料與提取液接觸的更充分。并且將離心的速度加大，離心時(shí)間加長，如第一步的離心速度由10 000 r/min 改為14 000 r/min;20 min 延長至60 min。宋學(xué)東［7］等在研究白樺花芽蛋白質(zhì)提取時(shí)發(fā)現(xiàn)高速離心辦法能較好地去除多糖的影響。金艷［9］等在對(duì)小麥葉片的總蛋白提取中也同樣發(fā)現(xiàn)高速離心和延長離心時(shí)間能夠除了部分多酚和醌類物質(zhì)，從而提高蛋白質(zhì)的提取率。同時(shí)，為了得到更多的蛋白質(zhì)，在裂解液中加入PMSF，來抑制絲氨酸和一些半光氨酸水解酶的作用，袁坤［3］等也通過加入PMSF 來以減少蛋白質(zhì)的降解。實(shí)驗(yàn)最終得到蛋白干粉，便于裂解，所以得到的蛋白質(zhì)質(zhì)量最多，蛋白的提取效率最高。雖然2－DE 的結(jié)果顯示得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)要少于其他2 種方法，但是凝膠背景干凈，蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰，且?guī)缀鯖]有橫縱條紋，說明用該方法提取的白樺木質(zhì)部蛋白雜質(zhì)較少。結(jié)合以上所述，酚提取法是目前較適于提取白樺木質(zhì)部蛋白的方法。

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