抗氧化劑對慢性胰腺炎大鼠胰腺纖維化的影響

朱穎 孫蘊(yùn)偉 章永平 袁耀宗 別里克

·論著·

抗氧化劑對慢性胰腺炎大鼠胰腺纖維化的影響

朱穎 孫蘊(yùn)偉 章永平 袁耀宗 別里克

目的觀察外源性給予四氫吡咯二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)等氧化劑對慢性胰腺炎(CP)大鼠胰腺纖維化的影響，并探討其機(jī)制。方法 按完全隨機(jī)法將大鼠分為對照組、CP組、PDTC治療組、維生素E(Vit E)治療組、維生素C(Vit C)治療組。采用腹腔內(nèi)注射二乙基二硫代氨基甲酸鹽(DETC) 750 mg/kg體質(zhì)量、每周2次的方法制備CP模型。對照組不做任何處理。各治療組在注射DETC后30 min腹腔內(nèi)分別注射PDTC 100 mg/kg體質(zhì)量、Vit E 15 mg/kg體質(zhì)量、Vit C 15 mg/kg體質(zhì)量。注射DETC后90 min，24、48、72 h，2、3、4、6周時分批處死大鼠。取胰腺組織行常規(guī)病理檢查，采用分光光度比值法檢測胰腺組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(GSH-PX)和谷胱甘肽過氧化物酶(MDA)活性，免疫組化法檢測α-平滑肌肌動蛋白(α -SMA)、結(jié)蛋白(Desmin)、膠原Ⅰ及Ⅲ、TGF-β1、纖維連接蛋白(FN)蛋白表達(dá)，RT-PCR法檢測TGF-β1mRNA、FN mRNA表達(dá)。結(jié)果 各治療組6周時胰腺纖維化指標(biāo)和腺體破壞指標(biāo)都明顯低于CP組(P值均<0.01)，VitC組和VitE組空泡樣變指數(shù)也小于CP組(P值均<0.01)。2周起PDTC組、Vit C組和Vit E組胰腺的SOD、GSH-PX活性均較同時間點(diǎn)CP組升高，而MDA含量較同時間點(diǎn)CP組下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01)，各治療組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2周后各治療組TGF-β1、FN mRNA水平均較CP組下降(P<0.05或<0.01)，但仍高于對照組(P值均<0.05)，各治療組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 PDTC等抗氧化劑通過增強(qiáng)SOD等活性減少氧自由基產(chǎn)生，抑制PSCs的活化，并通過降低TGF-β1分泌，減少膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、FN的產(chǎn)生，抑制胰腺的纖維化。

胰腺炎，慢性； 纖維化； PDTC； 抗氧化劑； 胰腺星形細(xì)胞

在慢性胰腺炎(CP)的發(fā)生和發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激不作為單一致病因素，但氧自由基增多導(dǎo)致的胰腺腺泡損傷是CP的重要發(fā)病原因[1]。CP患者尤其是多次急性發(fā)作者的血清氧自由基濃度明顯增高，胰腺組織中亦有氧自由基的積聚，并伴有不同程度抗氧化物質(zhì)的減少。抗氧化劑治療已被證明能有效地減輕繼發(fā)于CP的腹痛[2-3]，并通過抑制胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells，PSCs)的活化來抑制胰島的纖維化[4]。本課題組曾采用大鼠腹腔內(nèi)注射超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)抑制劑二乙基二硫代氨基甲酸鹽(diethyldithiocarbamate，DETC)的方法建立CP模型[5]。本研究應(yīng)用四氫吡咯二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine derivative of dithiocarbamate，PDTC)等抗氧化劑干預(yù)CP大鼠， 觀察其對CP大鼠PSCs活化及胰腺組織纖維化的影響，探討其作用機(jī)制。

材料與方法

一、動物模型建立及分組

雄性Wistar大鼠165只，體質(zhì)量220～250 g，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供。通過完全隨機(jī)法分為對照組、CP組、PDTC治療組、維生素C(Vit C)治療組、Vit E治療組。對照組5只大鼠不做任何處理，其余4組均采用腹腔內(nèi)注射DETC 750 mg/kg體質(zhì)量、每周2次的方法制備CP模型[5]，每組40只大鼠。各治療組大鼠在注射DETC后30 min分別注射PDTC 100 mg/kg體質(zhì)量、Vit E 15 mg/kg體質(zhì)量、Vit C 15mg/kg體質(zhì)量。初次注射DETC后90 min，24、48、72 h，2、3、4、6周分批處死大鼠，取胰腺組織，部分液氮保存，部分4%甲醛固定。

二、胰腺組織病理學(xué)檢查

取固定胰腺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，由病理科醫(yī)師閱片，并參考Su等[6]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行CP病理評分。

三、胰腺組織SOD、GSH-PX活性及MDA含量測定

取液氮冷凍的大鼠胰腺組織，剪取50 mg，應(yīng)用組織勻漿液制備勻漿，4 000 g離心15 min，取上清液。應(yīng)用蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)定量蛋白濃度。應(yīng)用SOD、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)檢測試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)測定SOD、GSH-PX活性和MDA含量，按試劑盒說明書操作。

四、胰腺組織α -SMA、Desmin、FN、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、TGF-β1蛋白表達(dá)檢測

采用免疫組化方法檢測胰腺組織α-平滑肌肌動蛋白( α-SMA)、結(jié)蛋白(Desmin)、纖維連接蛋白(FN)、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、TGF-β1 蛋白表達(dá)?？功?SMA、Desmin免疫組化檢測盒和抗膠原Ⅰ、Ⅲ單抗購自美國Sigma公司；抗FN單抗和抗TGF-β1抗體購自福建邁新科技有限公司；羊抗兔IgG購自Santa Cruz生物科技有限公司。按試劑盒說明書操作，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，透明、封片，光鏡下閱片。每切片取5個視野，計算陽性細(xì)胞百分比，0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；按染色強(qiáng)度，無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩分值相乘，0分為陰性(-)、1～4分弱陽性(+)、5～8分陽性(++)、9～12分強(qiáng)陽性(+++)。

五、胰腺組織TGF-β1、FN mRNA檢測

取液氮冰凍的胰腺組織，融化后采用Trizol(Gibcol公司)提取組織總RNA。先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再行PCR擴(kuò)增。TGF-β1正義序列5′-CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC-3′，反義序列5′-CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物298 bp，F(xiàn)N正義序列：5′-ACATTGATCGCCCTAAAGGA-3′，反義序列：5′-CTGTGGACTGGGTTCCAAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物270 bp，以β-actin為內(nèi)參。引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外照相儀攝片，圖像分析軟件獲取條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示mRNA相對表達(dá)量。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺組織病理改變

對照組大鼠胰腺組織均正常。CP組大鼠1 d時見胰腺組織內(nèi)有出血、炎性細(xì)胞浸潤、空泡樣變；2周時出現(xiàn)胰腺導(dǎo)管增生，間質(zhì)內(nèi)纖維組織增生，偶見細(xì)胞脂肪變性，無明顯腺體破壞；3周時胰周和小葉間見較明顯纖維組織，腺泡細(xì)胞之間也出現(xiàn)纖細(xì)的纖維組織；4周時部分腺體萎縮，脂肪浸潤，被部分纖維組織替代；6周時胰腺組織間隔明顯增寬，大量纖維組織增生，腺體萎縮被纖維組織或脂肪包繞、替代。各治療組大鼠的胰腺水腫和導(dǎo)管增生明顯，炎性細(xì)胞浸潤較CP組減輕，脂肪浸潤少見，組織間隙增寬，但以水腫為主，間隙內(nèi)未見到明顯的纖維組織，胰周、小葉間和小葉內(nèi)無明顯纖維組織增生，偶見細(xì)胞脂肪變性，無明顯的腺泡破壞，直到6周也未見明顯的纖維化和腺泡萎縮、破壞(圖1)。

CP組6周時胰腺的空泡樣變、葉間纖維化、葉內(nèi)纖維化、脂肪浸潤及纖維化指標(biāo)、腺體破壞指標(biāo)的評分均顯著高于對照組。各治療組6周時胰腺的葉間纖維化、葉內(nèi)纖維化、脂肪浸潤、纖維化指標(biāo)、腺體破壞的評分均顯著低于CP組，VitC組和VitE組胰腺的空泡樣評分也顯著低于CP組(P值均<0.01，圖2)。

二、各組大鼠胰腺組織SOD、GSH-PX活性和MDA含量變化

對照組大鼠SOD、GSH-PX活性及MDA含量分別為(6.21±0.48)、(5.62±0.63) NU/mg、(0.20±0.04)nmol/mg。CP組各時間點(diǎn)大鼠胰腺組織SOD、GSH-PX活性均較對照組顯著下降，MDA含量均較對照組顯著升高(P值均<0.05) 。各治療組大鼠在72 h內(nèi)胰腺組織SOD、GSH-PX活性均較對照組顯著下降，而顯著高于同時間點(diǎn)CP組大鼠，但MDA含量顯著高于對照組，而顯著低于CP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01)；2周后SOD、GSH-PX活性較同時間點(diǎn)CP組大鼠顯著升高，而MDA含量較同時間點(diǎn)CP組大鼠顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。但各治療組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表2、3、4)。

圖1 CP組(1A)、PDTC組(1B)、Vit C組(1C )、Vit E組(1D)大鼠6周時的胰腺病理改變(HE ×400)

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與CP組比較，cP<0.05，dP<0.01圖2 對照組、CP組及各治療組6周時的胰腺病理評分

SOD與GSH-PX活性呈正相關(guān)(r=0.538，P<0.01)，SOD、GSH-PX活性與MDA含量均呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.528、-0.502，P值均<0.01)。

SOD、GSH-PX活性與胰腺纖維化、胰腺破壞評分均呈顯著負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.531、-0.497、-0.418、-0.560，P值均<0.01)，而MDA含量與胰腺纖維化、胰腺破壞評分均呈顯著相關(guān)(r值分別為0.545、0.493，P值均<0.01)。

表2 各組大鼠胰腺組織SOD活性變化

注：與CP組比較，aP<0.05，bP<0.01

表3 各組大鼠胰腺組織GSH-PX活性變化

注：與CP組比較，aP<0.05，bP<0.01

表4 各組大鼠胰腺組織MDA含量變化

注：與CP組比較，aP<0.05，bP<0.01

三、胰腺組織α-SMA、Desmin、TGF-β1、膠原Ⅰ 、膠原Ⅲ、FN蛋白表達(dá)

α-SMA和Desmin蛋白表達(dá)于小葉間質(zhì)、血管周邊和腺泡旁；TGF-β1表達(dá)于小葉間質(zhì)的結(jié)締組織內(nèi)，腺泡間也有少量表達(dá)；膠原Ⅰ、膠原Ⅲ表達(dá)在腺泡之間，呈網(wǎng)格狀包繞腺泡；FN主要表達(dá)在葉間纖維組織內(nèi)，呈樹枝狀分布。

CP組大鼠胰腺組織自2周起α-SMA、Desmin、TGF-β1陽性表達(dá)，4、6周時無明顯增強(qiáng)；FN、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ在2周時弱陽性表達(dá)，至4周時呈強(qiáng)陽性表達(dá)。各治療組大鼠胰腺組織α-SMA、Desmin、TGF-β1也陽性表達(dá)，但較CP組減弱，呈弱陽性(圖3、4)；FN、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ少量弱陽性表達(dá)，未形成樹枝狀或網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖3 6周時CP組(3A)與PDTC組(3B)大鼠胰腺內(nèi)α-SMA的表達(dá)(免疫組化 ×100)

圖4 6周時CP組(4A)與PDTC組(4B)大鼠胰腺內(nèi)TGF-β1的表達(dá)(免疫組化 ×100)

圖5 6周時CP組(5A)與PDTC組(5B)大鼠胰腺內(nèi)膠原I的表達(dá)(免疫組化 ×100)

四、胰腺組織TGF-β1、FN mRNA表達(dá)

對照組大鼠胰腺組織TGF-β1 、FN mRNA表達(dá)量分別為0.4562、0.4147；CP組大鼠胰腺組織TGF-β1 、FN mRNA表達(dá)量均較對照組顯著增加，各治療組大鼠胰腺組織TGF-β1、FN mRNA表達(dá)量較CP組顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，而各治療組之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表5)。

表5 各組大鼠胰腺組織TGF-β1、FN mRNA表達(dá)量

注：與CP組比較，aP<0.05，bP<0.01

討 論

文獻(xiàn)報道，氧自由基增多導(dǎo)致的胰腺腺泡損傷是CP的重要發(fā)病機(jī)制[1]。Dhingra等[3]報道，急慢性胰腺炎患者血清SOD等抗氧化酶減少，應(yīng)用抗氧化劑治療可緩解患者的疼痛，并減少CP急性復(fù)發(fā)。Ryu等[4]報道，抗氧化劑通過抑制胰腺星狀細(xì)胞(PSCs)的活化而抑制胰島的纖維化。Lee等[7]報道，抗氧化劑可以通過減少胰島的纖維化，保護(hù)胰腺β細(xì)胞。高濃度的Vit C是自由基清除劑，還能使氧化的Vit E還原，兩者有協(xié)同作用。另有報道證實(shí)Vit E的水解產(chǎn)物α生育酚有治療CP的作用[8-9]， PDTC作為一種抗氧化劑，可通過抑制NF-κB的活性減輕重癥急性胰腺炎的臟器損傷[10]，但對于CP的治療作用尚無報道。

MDA含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，并間接反映細(xì)胞受損程度，而SOD和GSH-PX是機(jī)體清除自由基的重要酶類，SOD和GSH-PX的活性強(qiáng)弱往往提示體內(nèi)抗氧化作用的強(qiáng)弱。本研究結(jié)果顯示，腹膜內(nèi)注入氧化劑DETC后，各時間點(diǎn)胰腺組織的SOD和GSH-PX活性均低于正常對照組，而MDA含量增高，前兩者與后者呈負(fù)相關(guān)，提示DETC通過抑制SOD和GSH-PX活性使機(jī)體清除氧自由基的能力下降，造成氧自由基過剩，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成大量MDA，這種作用在72 h內(nèi)尤為明顯。2周后CP組SOD、GSG-PX活性雖有所回升，但仍低于正常對照組，提示大鼠胰腺內(nèi)自身的抗氧化機(jī)制有所激活，但仍低于正常水平。3周后CP組大鼠胰腺出現(xiàn)明顯纖維化，并伴有脂肪浸潤，腺體破壞等改變，可見長期慢性氧化刺激可能為CP發(fā)病機(jī)制中的重要因素。而用3種抗氧化劑治療后，治療組各時間點(diǎn)胰腺的SOD、GSH-PX活性均高于CP組；MDA含量較CP組減少，提示PDTC、Vit C和Vit E均可通過清除自由基降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物有效地對抗了DETC對SOD、GSH-PX活性的抑制作用，增強(qiáng)了清除自由基的能力，保護(hù)胰腺細(xì)胞。3周后治療組大鼠胰腺空泡樣變和脂肪變性較CP組明顯減少，與正常對照組大鼠相比，治療組大鼠胰腺水腫明顯，但增寬的組織間隙內(nèi)并未見到明顯的纖維組織，小葉內(nèi)的纖維化和腺體的萎縮破壞更是少見，相關(guān)性分析也證實(shí)了MDA含量與胰腺的纖維化和破壞程度顯著相關(guān)，而SOD和GSH-PX活性與之呈顯著負(fù)相關(guān)，表明抗氧化劑通過減少體內(nèi)的氧自由基，避免其對胰腺的腺泡細(xì)胞長期攻擊而造成細(xì)胞變性壞死以及對炎性細(xì)胞的趨化作用，減輕胰腺的損害，抑制纖維組織的增生。這也再一次證實(shí)氧化應(yīng)激在CP發(fā)病中的作用，抗氧化治療是抗胰腺纖維化的重要機(jī)制。受樣本量限制，不管是SOD、GSH-PX活性和MDA含量還是胰腺纖維化程度，3種不同藥物治療組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Desmin和α-SMA是PSCs活化的標(biāo)志。活化的PSCs促使TGF-β1分泌，TGF-β1反過來又促進(jìn)PSCs的活化。PSCs分泌的膠原Ⅰ、膠原Ⅲ和FN等膠原成分增多，它們沉積在腺泡周圍及間質(zhì)中，最后在小葉間甚至小葉內(nèi)形成大量纖維組織，這是CP的病理基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，治療組胰腺組織膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、FN、α-SMA、Desmin、TGF-β1在組織內(nèi)表達(dá)均較CP組下調(diào)，以膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、FN尤為明顯。CP組大鼠α-SMA和Desmin主要表達(dá)在腺體間質(zhì)、腺泡旁以及血管周邊，治療組α-SMA主要在血管周圍表達(dá)，標(biāo)記正常的平滑肌細(xì)胞，而腺泡間僅有少量α-SMA和Desmin表達(dá)，提示PSCs的增生和活化被抑制。TGF-β1可由PSCs分泌，一定程度上反映了PSCs的活化與纖維化程度相關(guān)。本研究的治療組TGF-β1分泌量較CP組減少，提示抗氧化劑可抑制TGF-β1的分泌。膠原Ⅰ和膠原Ⅲ是膠原的主要成分，在CP組大鼠胰腺腺泡之間表達(dá)，構(gòu)成網(wǎng)格狀包繞腺泡結(jié)構(gòu)，治療組膠原Ⅰ、Ⅲ在腺泡之間少量表達(dá)，不構(gòu)成網(wǎng)格狀，可能跟PSCs活化被抑制及TGF-β1分泌減少有關(guān)。

綜上所述，PDTC等3種抗氧化劑通過清除多余的氧自由基保護(hù)胰腺腺泡細(xì)胞，抑制PSCs增殖，導(dǎo)致TGF-β1的分泌減少，膠原Ⅰ、Ⅲ及FN等膠原成分分泌減少，明顯減輕大鼠胰腺纖維化和腺體萎縮的程度。但3種抗氧化劑的療效并無統(tǒng)計學(xué)差異。PDTC作為一種新的抗氧化劑，由于可抑制NF-κB活性，其對CP治療的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

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(本文編輯：屠振興)

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Effect of antioxidants on pancreatic fibrosis of rats with chronic pancreatitis

Zhuying,Sunyunwei,ZhangYongping,YuanYaozong,BieLike.DepartmentofGastroenterology,RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China

Correspondingauthor:BieLike,Email:BK_ERCP@163.com

Objective To investigate the effect of antioxidants including PDTC on pancreatic fibrosis of rats with chronic pancreatitis. Methods The rats were randomly divided into 5 groups including control group, CP group, PDTC treatment group, vitamin E treatment group and vitamin C treatment group. The CP model was in ducad by using intraperitoneal injection of DETC (750 mg/kg), twice a week. The control group received no treatment. After DETC injection, the treatment groups received an intraperitoneal injection of PDTC (100 mg/kg), vitamin E (15 mg/kg), vitamin C (15 mg/kg), respectively. Rats were sacrificed at 90 min, 24 h, 48 h, 72 h, 2 w, 3 w, 4 w, 6 w after first injection of DETC. Pancreatic tissue was taken for routine pathological examination. The activity of SOD, GSH-PX and MDA content were detected by spectrophotometric ratio method. α-SMA, desmin collagen Ⅰ, Ⅲ, TGF-β1, FN were detected by immunohistochemical assay. The expression of TGF-β1, FN mRNA was measured by RT-PCR. Results At 6w, the fibrosis and the parameters for damage of the pancreas in the three treatment groups were significantly better than that in CP group (P<0.01), the vacuolar degeneration index in vitamin E group and vitamin C group was also better than that in CP group (P<0.01). From the 2nd week, the activity of SOD, GSH PX in PDTC group, Vit C group and Vit E group was higher than that in CP group, while the MDA activity was lower than that in CP group, and the difference was statistically significant (P<0.01 orP<0.05). No significant difference was found among the three treatment groups. The mRNA levels of TGF-β1 and FN of the treatment groups were lower than those of CP group (P<0.05 orP<0.01), but higher than those of the control group (P<0.05). There was no significant difference among the three treatment groups (P>0.05). Conclusions PDTC and the other antioxidants can reduce oxygen free radicals by increasing the activity of SOD, suppressing the activation of PSCs, reducing the secretion of TGF-β1, Collagen Ⅰ, Ⅲ, FN and eventually inhibit the progress of pancreatic fibrosis.

Pancreatitis, chronic ; Fibrosis; PDTC; Antioxidants; Pancreatic stellate cells

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.06.008

200025 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科

別里克，Email: BK_ERCP@163.com

2015-03-17)