UPLC-MS法測定大鼠血漿中葒草花的3個指標(biāo)成分及其藥動學(xué)研究

黃 勇，胡 杰，陸 苑，鄭 林，蘭燕宇，李勇軍

（貴陽醫(yī)學(xué)院1．貴州省藥物制劑重點實驗室，2．民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，3．藥學(xué)院，貴州貴陽 550004）

UPLC-MS法測定大鼠血漿中葒草花的3個指標(biāo)成分及其藥動學(xué)研究

黃 勇1，3，胡 杰1，陸 苑1，3，鄭 林1，3，蘭燕宇2，3，李勇軍2，3

（貴陽醫(yī)學(xué)院1．貴州省藥物制劑重點實驗室，2．民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，3．藥學(xué)院，貴州貴陽 550004）

中國圖書分類號：R-332；R282.71；R284.1；R969.1

摘要：目的 建立UPLC-MS法測定大鼠口服葒草花提取物后血漿中原兒茶酸、山柰素－葡萄糖、槲皮苷的分析方法，并用該方法研究原兒茶酸等3個指標(biāo)成分的藥物代謝動力學(xué)。方法 血漿樣品選擇酸化后甲醇沉淀蛋白，Waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）柱，流速：0.30 mL·min－1，流動相：0.1%甲酸乙腈－0.1%甲酸水梯度洗脫，采用電噴霧電離源（ESI），掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測（SIR）。結(jié)果 3種成分分別在2.74～677、0.69～186、0.82～200 μg·L－1呈良好線性關(guān)系。提取回收率、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性均良好達(dá)到測定要求。原兒茶酸、山柰素－葡萄糖和槲皮苷3個指標(biāo)成分的Tmax（h）分別為0.46±0.1、0.79±0.33和2.63± 4.6，Cmax（μg·L－1）分別為463.8±207.81、18.53±7.82和137.38±71.09。結(jié)論 建立的UPLC-MS檢測方法具有特異、快速、準(zhǔn)確和靈敏的特點，能夠同時測定生物樣品中原兒茶酸等3種成分的血藥濃度，并成功應(yīng)用于葒草花在正常大鼠體內(nèi)這3個指標(biāo)成分的藥動學(xué)研究。

關(guān)鍵詞：葒草花；大鼠；UPLC-MS；原兒茶酸；山柰素－葡萄糖；槲皮苷；藥代動力學(xué)

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．026．html

葒草花為蓼科植物葒蓼（Polygonum orientale L．）的花序，又名水葒花；葒草花具有行氣活血，消積，止痛的功效，用于治療頭痛、心胃氣痛、腹中痞積等。課題組在對葒草各部位藥理篩選實驗中發(fā)現(xiàn)，葒草花水煮醇沉后的正丁醇萃取部位有較強的抗心肌缺血，減少心肌梗死面積作用?；瘜W(xué)成分研究表明，主要含有酚酸類的原兒茶酸及黃酮類的山柰素

－葡萄糖苷、槲皮苷等成分，文獻報道該類化合物為主要活性成分［1］。

為此，課題組以原兒茶酸、山柰素－葡萄糖苷和槲皮苷為指標(biāo)性成分，研究大鼠灌胃葒草提取物后體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，考察3個指標(biāo)成份在大鼠體內(nèi)的經(jīng)時過程，獲得其動力學(xué)參數(shù)，為進一步研究開發(fā)葒草及其制劑奠定基礎(chǔ)［2－3］。

1　材料與方法

1．1藥品與試劑 原兒茶酸對照品（批號809－200102，純度≥0.98，中國藥品生物制品鑒定所）；葛根素（批號0752－9605，純度≥0．98，中國藥品生物制品鑒定所）；槲皮苷對照品、山柰素－葡萄糖對照品對照品（均自制，純度≥0.98）；甲醇、乙腈和甲酸等試劑均為色譜純。

1．2儀器 WATERS ACQUITY UPLC超高壓液相三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（二元梯度泵，真空脫氣機，柱溫箱，Masslynx 4．1質(zhì)譜工作站，自動進樣器）；Al-legra 64R低溫高速離心機（美國Beckman Coulter公司）；AE240十萬分之一電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；MTN-2800D氮吹濃縮裝置（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；CQ 250A-TS超聲波清洗機（上海躍進醫(yī)用光學(xué)器械廠）；ZH-2渦旋混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。

1．3實驗動物 健康Wistar大鼠♀♂兼用，體質(zhì)量為（230±20）g，由貴陽醫(yī)學(xué)院動物中心提供［批號SCXK（黔）2002－0001］。

1．4藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)處理 采用DAS2．0數(shù)據(jù)處理軟件進行藥代動力學(xué)參數(shù)計算和數(shù)據(jù)擬合，選取最小AIC值擬合房室模型，AUC0－t，MRT等參數(shù)選用統(tǒng)計矩方法計算。并對AUC0－t，MRT進行方差分析確定其動力學(xué)模型。

1．5標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1．5．1原兒茶酸等3種物質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取原兒茶酸、槲皮苷和山柰素－葡萄糖適量，用甲醇定容至10 mL。獲得原兒茶酸（1.202 g ·L－1）、槲皮苷（1.200 g·L－1）和山柰素－葡萄糖（1.216 g·L－1）的儲備液。分別精密量取原兒茶酸等3種對照品儲備液適量，用甲醇按梯度稀釋成所需濃度，得混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。置冰箱（－20℃）保存，備用。

1．5．2內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取葛根素（10.33 mg），用甲醇定容至25 mL。獲得葛根素（0.4 132 g ·L－1）的儲備液。取內(nèi)標(biāo)儲備液適量至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成2 mg·L－1的內(nèi)標(biāo)溶液，置冰箱（－20℃）保存，備用。

1．6色譜條件 色譜柱Waters BEH C18（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm）柱，保護柱：Waters Van Guard BEH C18（2.1 mm×5 mm，1.7 μm），柱溫：45℃，流動相：0.1%甲酸乙腈－0．1%甲酸水梯度洗脫。進樣體積為1 μL。液相梯度見Tab 1。

Tab 1 Four components chromatographic conditions

1．7質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源（ESI），毛細(xì)管電離電壓：3 kV，離子源溫度：120℃；噴霧氣與反吹氣：氮氣，去溶劑氣流速：650 L·h－1，掃描方式為選擇性離子監(jiān)測（SIR），原兒茶酸等3種成分及內(nèi)標(biāo)用于定量分析的監(jiān)測離子，見Tab 2。

Tab 2 Three components mass spectrometric conditions

1．8血漿樣品處理方法 取大鼠血漿100 μL，置1.5 mL塑料離心管中，補加50 μL甲醇，依次加入2 mg·L－1內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，50 μL 1%甲酸，400 μL甲醇，渦混1 min，超聲5 min，離心10 min（4℃、15 000r·min－1），取上清液置離心管中，48℃下氮氣吹干，殘留物加500 μL甲醇復(fù)溶，超聲10 min，渦混1 min，離心10 min（4℃、15 000 r·min－1），取上清液48℃下氮氣吹干，殘留物200 μL初始流動相溶解，取上清液進樣UPLC-MS分析。

1．9實驗方案與樣品檢測 健康Wistar大鼠6只，♀♂兼用，體質(zhì)量為（230±20）g，給藥劑量分別為2．5 g·kg－1，給藥前12 h禁食，自由飲水?？诜辔溉嚥莼ㄌ崛∥锶芤?。于給藥后5、10、15、30、60 min，2 h、3 h、5 h、7 h、9 h、12 h、24 h、36 h經(jīng)尾靜脈取血約0.4 mL置涂有肝素的塑料離心管中，4 500 r ·min－1離心8 min，分離血漿于－20℃冰箱中保存，直至分析。

2　結(jié)果

2．1UPLC-MS分析方法的確證

2．1．1專屬性 在其選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下原兒茶酸、山柰素－葡萄糖苷、槲皮苷3種物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)葛根素監(jiān)測離子反應(yīng)分別為m／z 153.0、m／z 449.3、m／z 449.2、m／z 417.2。空白血漿、空白血漿外加原兒茶酸等3種物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)以及大鼠給藥后血漿樣品色譜圖，原兒茶酸等3種物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為（1.25、2.70、2.78和1.73 min），各成分間分離良好，未見血漿中雜質(zhì)干擾。

Fig 1 Typical UPLC-MS chromatograms of rat blank plasma（A）；blank plasma spiked with three components and IS（B）；the rat plasma sample collected at 30 min after i．g of 2．5 g·kg－1of the flower of Poly-gonumorientale L．extract to rat（C）；1．protocatechuie acid；2．puerarin （IS）；3．kaempferol-3-O-β-D-glucoside；4．quercitrin

2．1．2線性范圍和靈敏度 取大鼠空白血漿100 μL，依次加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，配制成相當(dāng)于大鼠血漿藥物濃度為見Tab 3，按“1.8血漿樣品處理方法”項下操作，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（A／Ai）為縱坐標(biāo)Y，各物質(zhì)濃度（C）為橫坐標(biāo)X進行直線回歸，權(quán)重系數(shù)為1／X，求的直線方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。大鼠血漿中原兒茶酸等3種成分在其線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99。典型大鼠標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍見Tab 4。

Tab 3 Concentrations of the four standard calibration samples（μg·L－1）

Tab 4 Mean values of regression equation of the analytes in rat plasma

2．1．3準(zhǔn)確度和精密度按 “2．1．2標(biāo)準(zhǔn)曲線”項下分別配制3種成分大鼠血漿高、中、低3個濃度的質(zhì)量控制樣品（QC），按“1.8血漿樣品處理方法”項下平行操作，每個濃度進行6樣本分析，日內(nèi)連續(xù)進樣，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時進行。每個系列濃度做6份，計算日內(nèi)精密度；3種濃度連續(xù)測定5 d，計算日間精密度。結(jié)果表明原兒茶酸等3種成分日內(nèi)和日間精密度RSD（%）均小于20%，準(zhǔn)確度范圍為88.28%～109.51%，提示該方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。

2．1．4提取回收率 取大鼠空白血漿100 μL，按“2．1．2標(biāo)準(zhǔn)曲線”項下分別配制3種成分的大鼠血漿低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制樣品（QC），每個濃度進行6樣本分析，以200 μL初始流動相溶解，記錄其峰面積。另取空白血漿，按“1．8血漿樣品處理方法”項下操作。離心后獲得上清液，加入與上述相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（每個濃度進行6樣本分析），于48℃氮氣吹干，以200 μL初始流動相溶解，獲得相應(yīng)峰面積值。以每一濃度的兩種處理方法的峰面積比值計算提取回收率，對原兒茶酸等3種成分線性范圍內(nèi)高、中、低3個濃度的血漿樣品提取回收率進行了考察。結(jié)果表明原兒茶酸等3種成分的回收率分別為：104.55%～107.45%、92.45%～100.82%、93.36%～97.39%，提示該方法可行。

2．1．5穩(wěn)定性考察 按“2．1．2標(biāo)準(zhǔn)曲線”項下分別配制原兒茶酸等3種成分的大鼠血漿低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制樣品（QC），樣品處理后至自動進樣器中，在6 h分別進樣，以每一濃度3樣本分析。結(jié)果表明原兒茶酸等3種成分的處理后血漿樣品在自動進樣器中6 h均穩(wěn)定。同法配制低、中、高3個濃度血漿樣品（QC），分別在室溫（約20℃）下放置6 h，4℃下冷藏8 h，凍融3次，經(jīng)處理后進樣測定濃度，以每一濃度3樣本分析。結(jié)果表明，3種成分血漿樣品在室溫下放置6 h，4℃下冷藏8 h和經(jīng)3次凍融循環(huán)均很穩(wěn)定。

2．2大鼠給藥后血漿濃度及藥物動力學(xué)參數(shù) 大鼠口服葒草花提取物后，原兒茶酸等3種物質(zhì)的濃度測定結(jié)果見Tab 5，平均血藥濃度－時間曲線（Fig 2）。采用DAS2.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)并對藥物在大鼠體內(nèi)的動力學(xué)過程進行房室模型擬合并計算其相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)見Tab 6。

Tab 5 Mean plasma concentrations（μg·L－1）of three components after i．g of 2．5 g·kg－1of the flower of Polygonumorientale L．extract to rat（±s，n＝6）

Tab 5 Mean plasma concentrations（μg·L－1）of three components after i．g of 2．5 g·kg－1of the flower of Polygonumorientale L．extract to rat（±s，n＝6）

Time／h　Protocatechuie acid Kaempferol-3-O-β-D-glucoside Quercitrin 0．083　154．12±132．75　6．30±1．69　45．23±18．38 0．17　257．70±190．98　8．61±4．53　48．19±22．58 0．25　361．04±259．28　13．15±9．87　90．64±68．22 0．5　386．29±114．37　13．73±6．43　98．02±46．88 1 263．71±45．90　10．31±3．80　73．22±31．43 2 193．35±47．23　5．35±2．17　39．96±4．82 3 126．57±69．20　5．20±0．71　42．82±10．66 5 39．04±20．73　4．24±2．14　39．61±9．08 7 15．97±10．86　2．23±1．47　33．66±22．21 9 5．82±7．49　3．07±3．31　35．92±27．74 12　2．15±1．08　3．38±2．88　38．47±20．80 24　3．90±1．77　1．66±1．48　19．70±8．02 36　5．11±2．36　2．30±2．83　16．80±15．29

Tab 6 Pharmacokinetic parameters of three components afteri．g of 2．5 g·kg－1of the flower of Polygonumorientale L．extract to rat（n＝6）

3　討論

生物樣品檢測方法的建立和驗證是整個藥代動力學(xué)研究的基礎(chǔ)，由于進行藥代動力學(xué)研究的生物樣品存在濃度較低，基質(zhì)環(huán)境復(fù)雜等難題，因此，如何建立快速有效、靈敏可靠的生物樣品分析方法將是本課題擬解決的關(guān)鍵問題之一，以實現(xiàn)高通量生物樣品分析過程，滿足藥代動力學(xué)研究大樣本量的要求［4］。

實驗中對流動相進行了考察，發(fā)現(xiàn)使用乙腈比甲醇各物質(zhì)的峰形較好。待測成分基本大多是黃酮類的成分，在實驗中有機相和水相均加入了0．1%的甲酸，甲酸的加入可以有利于它們以游離狀態(tài)存在。同時實驗最開始用的是Waters C18（2.1 mm× 50 mm）的色譜柱，分離效果不理想，山奈素－葡萄糖苷與槲皮苷的分離難度較大，后用2.1 mm×100 mm的色譜柱進行替換，兩者能得到較好的分離。實驗中發(fā)現(xiàn)采用負(fù)離子檢測模式線性不理想，可能是管道中存留的磷酸的影響，最后3種黃酮類成分選擇正離子檢測模式，酚酸類的原兒茶酸選擇負(fù)離子檢測模式，結(jié)果良好。

Fig 2 Concentration-time profiles of three components after i．g of 2.5 g·kg－1of the flower of Polygonumorientale L．extract to rat（n ＝6）

被測成分原兒茶酸、山奈素－葡萄糖苷和槲皮苷均為極性較大的弱酸性化合物，在酸性條件下處于非解離狀態(tài)，有利于被測成分的提取。因此我們對在血漿樣品處理中是否加酸及加酸的種類進行了考察，實驗結(jié)果表明，加酸后明顯有利于被測成分的提取；同時不同的酸（甲酸、鹽酸、磷酸）對其提取效

率也不同，其中甲酸的效果最好，因此我們在樣品處理時加入了50 μL 1%甲酸［5－7］。

（致謝：本實驗在貴州省藥物制劑重點實驗室和民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心聯(lián)合完成。真誠感謝貴州省藥物制劑重點實驗室和民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心為本實驗開展提供相關(guān)實驗耗材與儀器設(shè)備。真誠感謝實驗室各位同事、老師在實驗中給予我的指導(dǎo)與幫助。）

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Pharmacokinetics of three index components in flower of Polygonumorientale L．in rat plasma by UPLC-MS

HUANG Yong1，3，HU Jie1，LU Yuan1，3，ZHENG Lin1，3，LAN Yan-yu2，3，LI Yong-jun2，3
（1．Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，School of Pharmacy，Guiyang Medical University，Guiyang 550004，China；2．Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM（Ministry of Education），Guiyang Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China；3．School of Pharmacy，
Guiyang Medical University，Guiyang 550004，China）

Abstract：Aims To establish a UPLC-MS method for quantifying protocatechuie acid，kaempferol-3-O-β-D-glucoside and quercitrin and to investigate the pharma-cokinetics of three indix components in flower of Poly-gonumorientale L．in rat plasma．Methods The anal-ysis was achieved by BEH C18column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）with a mobile phase composed of 0.1% formic acid using step gradient elution．A TQD tandem mass spectrometry equipped with electrospray ionization source was used as detector and operated by selected ion recording（SIR）mode．Results In the selected linear range，calibration curves of the three markers components showed good linearity．Extraction recovery rate，precision，accuracy and stability reached the de-termination request．The parameters of Tmax（h）in three index components were 0.46±0.1，0.79±0.33 and 2.63±4.6，respectively；Cmax（μg·L－1）in three index components were 463.8±207.81，18.53±7.82 and 137.38±71.09，respectively．Conclusion The fully validated UPLC-MS method has been successfully applied to the pharmacokinetic study of the three index components in flower of Polygonumorientale L．in rat plasma．

Key words：flower of Polygonumorientale L．；rat；UP-LC-MS；protocatechuie acid；kaempferol-3-O-β-D-glu-coside；quercitrin；pharmacokinetics

作者簡介：黃 勇（1976－），男，教授，研究方向：中藥活性成分及新藥開發(fā)，Tel：0851-6908899，E-mail：hujie51619＠sina．cn；李勇軍（1973－），男，教授，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及新藥開發(fā)，通訊作者，Tel：0851-6908899，E-mail：759843 553＠qq．com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81360664）；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項項目（黔科合重G字［2013］4001）；貴州省高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計劃（黔教合協(xié)同創(chuàng)新字［2013］04）

收稿日期：2015－04－29，修回日期：2015－06－20

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1314－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．026