四物湯及其有效成分對大鼠肝臟主要藥物代謝酶的影響

馬增春，梁 淼，趙佳偉，2，王宇光，譚洪玲，梁乾德，湯響林，肖成榮，高 月

（1．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2．安徽醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，安徽合肥 230032）

四物湯及其有效成分對大鼠肝臟主要藥物代謝酶的影響

馬增春1，梁 淼1，趙佳偉1，2，王宇光1，譚洪玲1，梁乾德1，湯響林1，肖成榮1，高 月1

（1．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2．安徽醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，安徽合肥 230032）

中國圖書分類號：R-332；R284．1；R289．5；R322.47；R345.99；R977.3

摘要：目的 研究四物湯及其有效成分對大鼠肝臟P450酶的影響，從藥物代謝酶角度為四物湯的配伍規(guī)律提供實驗依據(jù)。方法 大鼠口服灌胃四物湯10 g·kg－1·d－1及其有效成分果糖0.334 g·kg－1·d－1，阿魏酸0.002 g·kg－1·d－1，川芎嗪0.011 g·kg－1·d－1，芍藥苷0.022 g·kg－1·d－1，連續(xù)給藥1周后處死，用生理鹽水灌流肝臟，制備肝微粒體，采用混合探針與肝微粒體體外孵育法考察四物湯及其有效成分對大鼠肝臟細(xì)胞色素P450酶的影響。利用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Q-PCR）檢測四物湯及其有效成分對大鼠肝臟P450 mRNA表達(dá)的影響，利用Western blot法檢測四物湯及其有效成分對大鼠肝臟CYP2B1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果肝微粒體孵育結(jié)果顯示，果糖對CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6酶活性具有抑制作用，阿魏酸對CYP2C9、CYP2B6酶活性具有抑制作用，川芎嗪對CYP1A2、CYP2C9、CYP2B6的酶活性具有抑制作用，芍藥苷對CYP2D6、CYP2B6酶活性具有抑制作用。阿魏酸、果糖、芍藥苷組對CYP2B1mRNA的表達(dá)具有抑制作用，與酶活性水平一致。4種單體成分對CYP2B1蛋白表達(dá)具有抑制作用。結(jié)論 阿魏酸、果糖、芍藥苷組在CYP450酶活性、mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平對CYP2B1均有抑制作用。

關(guān)鍵詞：四物湯；果糖；阿魏酸；川芎嗪；芍藥苷；P450酶

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．027．html

中藥化學(xué)成分多種多樣，當(dāng)作為口服藥物應(yīng)用時，有些中藥成分可直接吸收，而有些成分在代謝過程中活性降低或轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的物質(zhì)，導(dǎo)致藥理學(xué)上的失活，還有些成分可代謝轉(zhuǎn)化為有藥理活性的物質(zhì)或活性增強而起作用，即活化過程。藥物在胃腸道的代謝過程包括Ⅰ相反應(yīng)和Ⅱ相反應(yīng)，催化Ⅰ相反應(yīng)的關(guān)鍵酶是細(xì)胞色素P450酶（CYP450）酶家族，作為機體對藥物或外源物代謝的最主要功能蛋白，主要包括6種重要亞型：CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4［1－2］。中藥強調(diào)合并用藥，方劑以復(fù)方為主，因此中藥配伍存在與P450酶有關(guān)的中藥間相互作用，藥物代謝酶是決定藥物體內(nèi)過程的關(guān)健因素，它們的抑制或誘導(dǎo)作用是藥物聯(lián)合應(yīng)用時產(chǎn)生藥動學(xué)相互作用的主要機制［3］。

四物湯（SiWu decoction，SWD）是補血名方，本室前期采用活性指導(dǎo)下的化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)了四物湯中促進(jìn)造血功能的主要物質(zhì)基礎(chǔ)為多糖、阿魏酸、川芎嗪、芍藥苷等，重構(gòu)了基于四物湯有效成分的新組方，并且首次揭示了芍藥苷具有促進(jìn)造血的活性［4－8］，四物湯及其配伍對大鼠肝臟P450酶的研究結(jié)果表明，四物湯復(fù)方對大鼠肝臟CYP1A2具有誘導(dǎo)作用，對CYP2B6具有抑制作用［6］。本文根據(jù)4種有效成分在四物湯中的百分含量確定藥物的給藥劑量，探索四物湯中4種有效單體成分對CYP450酶活性影響，進(jìn)一步在基因和蛋白水平進(jìn)行確證，從藥物代謝酶角度為四物湯配伍規(guī)律提供實驗依據(jù)。

1　材料

1．1藥品與試劑 四物湯由熟地、當(dāng)歸、白芍、川芎組成，全部購自同仁堂中藥廠。果糖、阿魏酸、磷酸川芎嗪、芍藥苷、咪達(dá)唑侖、甲苯磺丁脲、非那西丁、右美沙芬、撲熱息痛、普萘洛爾均購于中國食品藥品檢定研究院。S-美芬妥因、1’-羥基咪達(dá)唑侖、4-羥基甲苯磺丁脲、4-羥基美芬妥因、右啡烷、安非他酮、4-羥基安非他酮均購自美國BD公司。還原型輔酶Ⅱ購自Roche公司。RNA提取試劑盒（Biomed公司），逆轉(zhuǎn)錄酶及Q-PCR擴增試劑（TransGen公司）。CYP1A2、CYP2C11、CYP2B1、CYP3A1及內(nèi)參β-actin引物由英濰捷基合成。脫脂奶粉、硝酸纖維膜購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。CYP2B1抗體購自Santa Cruz公司（美國），發(fā)光劑購自Milli-pore Coporation，過硫酸胺購于Amersham Biosciences公司，TEMED購自生工生物工程（上海）有限公司，抗GADPH鼠單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG、蛋白分

子量marker、組織蛋白抽提試劑盒、高效顯影液試劑、30%丙烯酰胺－甲叉雙丙烯酰胺、2×Sample Buffer、吐溫-20均購自北京康為試劑公司。甲醇和乙腈為色譜純，購自Fisher（美國），實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。

1．2動物和分組 Wistar大鼠，在動物中心飼養(yǎng)3 d后，進(jìn)行稱重，隨機分組。分為空白對照組、四物湯組、果糖組、阿魏酸組、川芎嗪組、芍藥苷組，每組8只動物。

1．3儀器 Agilent 1290型超高效液相色譜儀（UHPLC，美國Agilent公司）；Agilent 6410B型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；Agilent ZORBAX EclipsePlus-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm，美國Agilent公司）；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京長安科學(xué)儀器廠）；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；Western blot轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），電泳儀（Amersham公司），轉(zhuǎn)移脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；BS 223S型電子天平（塞多利斯科學(xué)儀器有限公司）；ABI Step One Plus熒光定量PCR儀（ABI公司）。

2　方法

2．1供試樣品的制備 四物湯水煎液按《太平惠民和劑局方》規(guī)定的劑量稱取組成，熟地15 g，當(dāng)歸10 g，白芍10 g，川芎6 g，共計41 g·d－1。四物湯復(fù)方組給藥劑量根據(jù)實驗室前期研究選取高劑量10 g ·kg－1·d－1，其他各組給藥劑量按其在復(fù)方中百分含量進(jìn)行換算（果糖3.34%，阿魏酸0.02%，川芎嗪0.11%，芍藥苷0.22%），即果糖0.334 g·kg－1· d－1，阿魏酸0.002 g·kg－1·d－1，川芎嗪0.011 g· kg－1·d－1，芍藥苷0.022 g·kg－1·d－1。連續(xù)灌胃給藥7 d，禁食，制備肝微粒體?？瞻讓φ战M給予等量的生理鹽水。

2．2肝微粒體的制備 參考本室建立的方法提取肝微粒體［9］，大鼠脫臼處死，用生理鹽水灌洗肝臟呈土黃色。將肝臟剪碎，按1∶4（W／V）加入TMS緩沖液，冰浴中勻漿后12 000×g，離心20 min，取上清液105 000×g離心60 min，棄上清，沉淀部分即微粒體。

2．3逆轉(zhuǎn)錄及實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Q-PCR）參考本室建立的方法進(jìn)行Q-PCR檢測［9］，大鼠處死后迅速取出肝臟，置于液氮中保存。按RNA提取試劑盒說明書提取肝臟總RNA。取總RNA 1μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，條件為42℃30 min，85℃5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，加入2×TransStart Green qPCR Super- Mix 10 μL，F(xiàn)orward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，Passive Reference Dye 0.4 μL，加ddH2O補足反應(yīng)體系至20 μL，熒光實時定量PCR的條件為94℃30 s，94℃5 s，60℃30 s，循環(huán)數(shù)為40。以β-actin作為內(nèi)參基因，進(jìn)行PCR擴增的實時定量分析，實驗重復(fù)測定3次。特異性引物序列見Tab 1。

Tab 1 Sequences of primers used for Q-PCR

2．4液質(zhì)聯(lián)用檢測條件 參考本室建立的方法進(jìn)行［9］，以流動相A（含0.1%甲酸和5 mmol·L－1甲酸銨的純水）和B（含0．1%甲酸的乙腈）梯度洗脫：30%B（0 min），95%B（1.5－3.5 min），30%B（3.6 min）；柱溫25℃，流速為0.45 ml·min－1，運行時間4.5 min；進(jìn)樣體積10 μL。內(nèi)標(biāo)為普奈洛爾（100 μg ·L－1）。以ESI源正離子MRM方式檢測，毛細(xì)管溫度320℃，毛細(xì)管電壓＋4000V，霧化電壓25psi，干燥氣流速10 L·min－1，其它質(zhì)譜分析參數(shù)見Tab 2。

Tab 2 Parameters of mass detection

2．5肝微粒體孵育體系 參考本室建立的方法進(jìn)行［10］，孵育體系包括肝微粒體（0.5 g·L－1），NAD-PH（1 mmol·L－1），CYP探針底物非那西?。?0 μmol·L－1）、甲苯磺丁脲（120 μmol·L－1）、美芬妥因（40 μmol·L－1）、右美沙芬（5 μmol·L－1）和咪達(dá)唑侖（5 μmol·L－1），K2HPO4／KH2PO4緩沖液（0.05 mol·L－1，pH＝7.4）補足體系至200 μL。37℃水浴預(yù)孵育5 min后加入同樣預(yù)孵育5 min的NADPH啟動反應(yīng)，37℃水浴孵育30 min，加入200 μL的甲醇∶乙腈（1∶1）含有內(nèi)標(biāo)鹽酸普奈洛爾100 mg·L－1的溶液終止反應(yīng)，13 000×g、4℃離心10 min，取上清液進(jìn)樣，定量分析各底物的代謝產(chǎn)物

生成率，測得酶活性。

2．6大鼠肝臟CYP2B1蛋白表達(dá)的測定 稱取0.1 g肝臟組織，加入1 mL組織蛋白抽提試劑，研磨后冰上孵育20 min，于10 000×g離心15 min提取蛋白，用BCA法測定蛋白含量。每組蛋白上樣量為20 μg，120V恒壓電泳。采用電轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)印3 h，用封閉液室溫下封閉1 h，加入稀釋后的CYP2B1一抗（1∶200）及GADPH抗體（1∶500）在室溫下孵育2 h，用TBST在室溫下脫色搖床洗3次。洗膜后加入適量稀釋的二抗，于室溫孵育1 h，用TBST室溫脫色搖床洗3次，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

3　結(jié)果

3．1四物湯及其成分對大鼠肝臟CYP450酶活性的影響 利用Cocktail探針法對給藥前后大鼠肝微粒體的酶活性變化進(jìn)行檢測，四物湯組及芍藥苷組與對照組相比對CYP1A2酶活性具有上調(diào)作用（P ＜0.05），果糖和川芎組與對照組相比對CYP1A2酶活性具有下調(diào)作用（P＜0.05）。四物湯、果糖、阿魏酸、芍藥苷以及川芎嗪組與對照組相比，對CYP2B6酶活性均具有抑制作用。果糖、阿魏酸、川芎嗪3組與對照組相比對CYP2C9酶活性具有下調(diào)作用，且果糖組下調(diào)作用較強。果糖組和芍藥苷組與對照組相比對CYP2D6酶活性具有下調(diào)作用。見Tab 3。

Tab 3 Effect of SiWu decoction and its active components on activity of CYP450（μmol·min－1·g Pro）

Fig 1 Effect of SiWu decoction and its active components on cytochrome P450 mRNA in rats detected by Q-PCR

3．2四物湯及其成分對大鼠肝臟CYP450 mRNA的影響 選擇CYP1A2、CYP2B1、CYP2C11、CYP3A1 4種CYP450酶亞型進(jìn)行在mRNA檢測，川芎嗪組與對照組相比對CYP1A2的mRNA具有下調(diào)趨勢，四物湯組與對照組相比對CYP1A2的mR-NA是上調(diào)趨勢，作用趨勢與酶活性水平一致。阿魏酸、果糖及芍藥苷3組與對照組相比對CYP2B1 的mRNA具有明顯抑制作用（P＜0.05），果糖組與對照組相CYP2C11的mRNA具有明顯抑制作用。見Fig 1。

3．3四物湯及其成分對大鼠肝臟CYP2B1蛋白的影響 利用Western blot檢測了大鼠肝臟CYP2B1的蛋白表達(dá)，研究結(jié)果顯示，與對照組相比，四物湯組、果糖、阿魏酸、芍藥苷、川芎嗪4組對CYP2B1的蛋白表達(dá)均降低。見Fig 2。

Fig 2 Effect of SiWu decoction and its active components on CYP2B1 in rats liver detected by Western blot

4　討論

細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450），屬于血紅素蛋白基因超家族，編碼一系列的代謝酶系統(tǒng)，主要存在于肝微粒中，參與生物體內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，90%臨床使用的藥物要經(jīng)過這些亞酶進(jìn)行I相代謝。細(xì)胞色素P450酶作為人體重要的I相藥物代謝酶系統(tǒng)，對藥物代謝和藥物之間的相互作用有著重要影響［11］。中藥方劑以復(fù)方為主，含有多種中藥，因此中藥配伍存在與P450酶有關(guān)的中藥間相互作用的機會可能更多，藥物對P450酶產(chǎn)生影響，進(jìn)一步受到影響的P450酶再作用于復(fù)方中其他成分，這就是基于P450酶的中藥配伍研究的分子基礎(chǔ)［12］。本文分析四物湯及其有效成分對P450酶活性、mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)基于藥物代謝酶的中藥相互作用模式，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

檢測四物湯中藥效學(xué)物質(zhì)果糖、阿魏酸、川芎嗪、芍藥苷對CYP450酶活性、mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)果糖對CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6酶活性具有抑制作用，并且對CYP2C9、CYP2C19的調(diào)節(jié)作用要強于其他成分。阿魏酸對CYP2C9、CYP2B6酶活性具有抑制作用，對其他亞酶活性無影響。川芎嗪對CYP1A2、CYP2C9、CYP2B6的酶活性具有抑制作用。芍藥苷對CYP1A2酶活性具有誘導(dǎo)作用，對CYP2D6、CYP2B6酶活性具有抑制作用。4種單體成分對CYP3A4酶活性和mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響并不是很明顯。阿魏酸、果糖、芍藥苷組對CYP2B1mRNA的表達(dá)具有抑制作用，與酶活性水平一致。進(jìn)一步考察4種單體成分對CYP2B1在蛋白水平表達(dá)的影響，結(jié)果也具有抑制作用，提示單體成分對CYP2B1的調(diào)控有可能是作用于蛋白翻譯環(huán)節(jié)，值得深入研究。

口服藥物的吸收可能會受到肝細(xì)胞對其代謝的影響，細(xì)胞色素P450酶介導(dǎo)了許多藥物之間的相互作用。從而改變了藥物的藥理－毒理效應(yīng)，導(dǎo)致藥效加強或副作用減輕，也可使某藥效降低，或使某效應(yīng)喪失，或出現(xiàn)毒性加重，或出現(xiàn)不應(yīng)有的毒副作用。本文研究結(jié)果說明復(fù)方對CYP1A2具有誘導(dǎo)作用，對CYP2B6具有抑制作用，四物湯、四味單藥以及兩兩配伍對CYP2B1的酶活性和mRNA表達(dá)有抑制作用［9］，4種單體成分對CYP2B1的酶活性和mRNA表達(dá)水平也有抑制作用，CYP2B1在四物湯配伍以及臨床合理用藥中的地位和作用值得進(jìn)一步研究。

（致謝：本實驗在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥理毒理研究室完成。）

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Effects of Si-Wu Decoction and its active components on cytochrome P450 in rats

MA Zeng-chun1，LIANG Miao1，ZHAO Jia-wei1，2，WANG Yu-guang1，TAN Hong-ling1，LIANG Qian-de1，TANG Xiang-lin1，XIAO Cheng-rong1，GAO Yue1
（1．Beijing Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；2．Graduate School of Anhui Medical University，Hefei 230032，China）

Abstract：Aim To study the influence of Si-Wu De-coction（SWD）and its active components on cyto-chrome P450 activity and mRNA expression in rats in order to provide an experimental basis for compatibility of SWD．Methods SWD and its active components were intragastrically administrated for seven days，the doses of SWD was 10 g·kg－1·d－1，the doses of fructose，ferulic acid，ligustrazine，peoniflorin were 0.334，0.002，0.011 and 0.022 g·kg－1·d－1，re-spectively．After administration for seven days，rats were executed，and liver microsomes were prepared．The effects of SWD and its active components on cyto-chrome P450 in rats were investigated by hybrid probe and liver microsomes incubation method．The level of mRNA expression in liver was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction using specific target primers for CYP450 genes．The level of protein expression of CYP2B1 was detected by Western blot．Results Compared with the control group，fructose significantly decreased the activity of CYP1A2，CYP2B6，CYP2C9，CYP2D6；ferulic acid significantly decreased the activity of CYP2C9，CYP2B6；ligus-trazine significantly decreased the activity of CYP1A2，CYP2C9，CYP2B6；peoniflorin significantly decreased the activity of CYP2D6，CYP2B6；fructose，ferulic acid，peoniflorin inhibited the mRNA expression of CYP2B1；fructose，ferulic acid，ligustrazine and peon-iflorin also inhibit the protein expression of CYP2B1．Conclusion Fructose，ferulic acid，peoniflorin inhib-it the activity of CYP2B1，decrease the expression lev-els of mRNA and protein of CYP2B1．

Key words：SiWu Decoction；fructose；ferulic acid；ligustrazine；peoniflorin；CYP450

作者簡介：馬增春（1970－），男，博士，副研究員，研究方向：中藥藥理學(xué)，E-mail：mazchun＠139．com；高 月（1963－），女，博士，研究員，研究方向：中藥藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：gaoyue＠bmi．a(chǎn)c．cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81130067，81274127）

收稿日期：2015－05－13，修回日期：2015－06－25

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1319－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．027