羅漢果提取物誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549凋亡的研究

劉 燦，蔡天宇，趙曉萌，馬蘭青，竇德泉，孫媛霞

［1．北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2．中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）］

羅漢果提取物誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549凋亡的研究

劉 燦1，2，蔡天宇1，趙曉萌1，馬蘭青1，竇德泉1，孫媛霞2

［1．北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2．中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）］

中國(guó)圖書分類號(hào)：R284．1；R329．25；R734.202；R979.1

摘要：目的 探討羅漢果醇誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用及可能的分子機(jī)制。方法 通過(guò)分離、純化得到羅漢果醇單體，以肺癌細(xì)胞A549為對(duì)象，采用MTT法檢測(cè)羅漢果醇對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用；利用熒光染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期；以蛋白印跡法檢測(cè)羅漢果醇對(duì)p21、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 羅漢果醇能抑制肺癌細(xì)胞的增殖，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期的作用；蛋白印跡檢測(cè)表明，羅漢果醇可以促進(jìn)p21表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)下降。結(jié)論 羅漢果醇通過(guò)調(diào)節(jié)p21、Bcl-2的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的凋亡。

關(guān)鍵詞：羅漢果；肺癌細(xì)胞A549；藥食兩用；細(xì)胞凋亡；p21；蛋白免疫雜交

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．025．html

肺癌作為高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤，對(duì)人們生命健康構(gòu)成巨大威脅。天然植物是藥物開(kāi)發(fā)的重要來(lái)源，植物代謝產(chǎn)物具有天然的抗癌、抑癌效果，從植物代謝產(chǎn)物中篩選和發(fā)掘新的化合物是開(kāi)發(fā)低毒高效抗癌藥物的重要途徑。

羅漢果（Siraitia grosvenorii）為衛(wèi)生部首批公布的“藥食兩用”中藥材，《中國(guó)藥典》記載羅漢果具有清熱潤(rùn)肺功效。羅漢果為葫蘆科植物，主要種植于我國(guó)廣西地區(qū)［1］。文獻(xiàn)報(bào)道，甜苷是羅漢果中的主要活性成分之一，研究發(fā)現(xiàn)羅漢果甜苷具有止咳、抗氧化、降糖、祛痰等作用［2－5］，說(shuō)明羅漢果對(duì)肺部疾病具有明確的藥用效果。

我們對(duì)羅漢果中單體成分進(jìn)行分離和活性篩選，發(fā)現(xiàn)羅漢果醇具有誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549凋亡的作用。目前，針對(duì)羅漢果醇活性的研究較少，其抑制癌癥機(jī)制不詳。實(shí)驗(yàn)首次探討了羅漢果醇對(duì)肺癌細(xì)胞的作用效果和機(jī)制，為羅漢果的“潤(rùn)肺”功效提供了新線索，同時(shí)為羅漢果的藥物開(kāi)發(fā)提供了參考和依據(jù)。

1　材料與方法

1．1試劑 羅漢果干果購(gòu)自北京同仁堂藥店。常規(guī)化學(xué)試劑購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥公司。Annexin V-FITC／PI雙染試劑盒（BD公司）；p21、Bcl-2、β-actin蛋白抗體購(gòu)自Sigma公司。XAD-16樹脂購(gòu)自Rohm＆Haas公司；Diaion PA樹脂購(gòu)自三菱公司。人肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)于上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，細(xì)胞接種于含10%小牛血清的RPMI 1640（Gibco公司）完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．2羅漢果醇的制備 羅漢果醇的制備方法如下：①將羅漢果粉碎，按羅漢果與水質(zhì)量比為1∶6～8的比例加入水，在80～95℃條件下提取2次，每次2 h，合并提取液；②向提取液中加入絮凝劑，除去提取液中的鞣質(zhì)和可溶性蛋白，得到澄清的水溶液；③將所述水溶液采用XAD-16樹脂進(jìn)行吸附，用30%～50%乙醇進(jìn)行洗脫，得到富集羅漢果甜苷的水－乙醇混合溶液；④將所述混合溶液減壓濃縮，并回收乙醇，濃縮至浸膏狀，向浸膏中加入4～5倍質(zhì)量的去離子水，稀釋浸膏，得到粗品甜苷的水溶液；⑤將粗品甜苷的水溶液采用Diaion PA樹脂進(jìn)行脫色處理，收集下柱液，得到富集液；⑥向所述富集液中加入鹽酸至終濃度0.5 mol·L－1，在80～90℃，反應(yīng)時(shí)間為6～8 h；⑦利用半制備液相色譜分離制得羅漢果醇。其HPLC圖如Fig 1所示（色譜條件：反相C18柱；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm；流動(dòng)相為乙腈／水，0～20 min，25%乙腈；20～40 min，25% ～50%乙腈；40～60 min，50%乙腈等度洗脫。流速為1.0 mL·min－1；柱溫25℃），得到純度＞98%的羅漢果醇。

Fig 1 HPLC of mogrol

1．3細(xì)胞活力檢測(cè) 胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞A549，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106·L－1，以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。加入100 μL含不同濃度藥物的培養(yǎng)液，使藥物終濃度分別為0.1、1、10、100、200、250 μmol·L－1，培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行MTT比色分析：向板孔中加入濃度為5 g ·L－1MTT液15 μL，37℃避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加DMSO 150 μL，搖床震蕩10 min，置于酶標(biāo)儀490 nm檢測(cè)吸光度（A），按以下公式計(jì)算抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率／%＝（對(duì)照組A490－試驗(yàn)組A490）／對(duì)照組A490× 100%。

1．4細(xì)胞形態(tài)觀察 將經(jīng)嚴(yán)格消毒的蓋玻片置于6孔板中，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞A549，將細(xì)胞調(diào)至濃度1×107·L－1，轉(zhuǎn)移至6孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后加入藥物，使藥物的終濃度分別為0、10、100 和250 μmol·L－1，培養(yǎng)24 h后，吸出廢液，每孔加入0.5 mL固定液，固定25 min，PBS洗2次，每次洗3 min，加入Hoechst 33258染液，室溫避光染色20 min。使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1．5細(xì)胞凋亡檢測(cè) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞A549，用藥物培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，用200 μL冷PBS洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞；加入50 μL的結(jié)合液（binding buffer）重懸細(xì)胞，加入2 μL的Annexin V-FITC混勻，加入5 μL PI混勻，避光、室溫作用10 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1．6細(xì)胞周期檢測(cè) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞A549，分別用不同濃度羅漢果醇培養(yǎng)24 h后，用0.25%胰酶消化，收集用藥組和對(duì)照組細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，70%冷乙醇（－20℃）固定，4℃過(guò)夜，離心去乙醇，用1 mL的PBS洗細(xì)胞1次，加入含RNase A的PBS 500 μL，再加入碘化丙啶（PI）染色混勻（RNase A終濃度為50 mg·L－1，PI終濃度為25 mg·L－1），37℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1．7p21、Bcl-2蛋白表達(dá)的分析 肺癌細(xì)胞A549藥物培養(yǎng)24 h。終止細(xì)胞培養(yǎng)后，吸除培養(yǎng)液，PBS （0.01 mol·L－1，pH 7.4）洗滌，加入含PMSF裂解液50 μL每孔，置冰浴裂解30 min，14 000 r·min－1離心10 min，獲得總蛋白。BCA比色法測(cè)蛋白濃度，取50 μg總蛋白，經(jīng)12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶（含0.1%Tween 20）封閉1 h，加抗體p21、Bcl-2以及β-actin，一抗4℃孵育過(guò)夜（β-actin作為上樣量對(duì)照）；TBS-T洗膜3次，每次5 min；加辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，用漂洗液（TBS-T）洗膜3次，每次10 min，加入ECL避光孵育5 min，熒光影像分析儀顯影、掃描、分析。

1．8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用±s表示。采用t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2．1羅漢果醇對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 2所示，羅漢果醇具有抑制肺癌細(xì)胞A549增殖的作用，隨著藥物濃度的增加，其抑制率也隨之增加（P＜0.05），顯示羅漢果醇對(duì)A549細(xì)胞具有抑制作用。

Fig 2 Inhibitory effects of mogrol on proliferation of A549 cells with different doses

2．2羅漢果醇對(duì)肺癌細(xì)胞形態(tài)的影響 熒光染色結(jié)果如Fig 3所示，對(duì)照組細(xì)胞核完整，著色均勻，熒光成彌散狀，未出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；藥物組中，隨藥物濃度的升高，細(xì)胞染色質(zhì)呈顆粒熒光狀，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞核發(fā)生裂解，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型特征，說(shuō)明羅漢果醇具有誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用。

2．3羅漢果醇對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，羅漢果醇可誘發(fā)肺癌細(xì)胞A549凋亡，隨著羅漢果醇濃度的升高，凋亡細(xì)胞比

例逐步增加（Fig 4），與“2．2”結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明羅漢果具有誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用。

Fig 3 Fluorescence photomicrograph of A549 cells stained with Hoechst 33258（×400）

Fig 4 Effect of mogrol on apoptosis of A549 cells

2．4羅漢果醇對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控 誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯是藥物抑制癌細(xì)胞增殖的重要途徑。如Fig 5所示，經(jīng)羅漢果醇處理后，A549細(xì)胞細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯變化，隨著羅漢果醇濃度的增加，處于G0／G1期細(xì)胞的比例逐漸升高，S期、G2期細(xì)胞數(shù)量則與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明羅漢果醇能阻斷A549細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)A549細(xì)胞G0／G1期阻滯。

Fig 5 Effect of mogrol on cell-cycle distribution in A549 cells

2．5羅漢果對(duì)p21、Bcl-2蛋白的影響 Bcl-2為抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞的程序性凋亡。如Fig 6B所示，經(jīng)過(guò)羅漢果醇處理的A549細(xì)胞，其Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯下降，Bcl-2蛋白的表達(dá)量與羅漢果醇劑量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，這也是羅漢果醇促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的重要原因。p21作為重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，對(duì)細(xì)胞周期的進(jìn)程發(fā)揮重要作用，過(guò)量的p21表達(dá)能干預(yù)細(xì)胞周期由G1期向S期發(fā)展進(jìn)程。蛋白免疫實(shí)驗(yàn)表明，藥物能上調(diào)p21蛋白的表達(dá)（Fig 6A），而p21的過(guò)表達(dá)可誘發(fā)細(xì)胞阻滯于G0／G1期，與細(xì)胞周期檢測(cè)的結(jié)果一致。

3　討論

羅漢果收錄于我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的“藥食同源”藥物名單之中。此外，羅漢果提取物通過(guò)了美國(guó)FDA認(rèn)證，從自身的藥用價(jià)值和安全性而言，羅漢果提取物具有被開(kāi)發(fā)成為低副作用藥物的潛力。

本研究從羅漢果中分離得到羅漢果醇單體，MTT法檢測(cè)顯示，羅漢果醇對(duì)A549細(xì)胞具有抑制作用。Hoechst 33258染色觀察、Annexin V-FITC／PI流式分析證實(shí)了羅漢果醇具有促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549凋亡的作用。流式細(xì)胞檢測(cè)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，羅漢果醇具有誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯的效果，經(jīng)藥物處理，A549細(xì)胞周期分布發(fā)生改變，G1期細(xì)胞比例升高，S期和G2期細(xì)胞比例降低，藥物誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G0／G1期阻滯。從以上結(jié)果分析，羅漢果醇可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。

Fig 6 Effects of mogrol on expression of p21 and Bcl-2 in A549 cells

針對(duì)羅漢果醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯的現(xiàn)象，本研究對(duì)A549中周期蛋白、抗凋亡蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。文獻(xiàn)報(bào)道，周期蛋白p21在細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6－7］，p21的上調(diào)可阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程［7－8］。Western blot結(jié)果顯示，藥物上調(diào)了A549細(xì)胞中p21蛋白的表達(dá)，藥物可能通過(guò)上調(diào)p21從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。Bcl-2蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用［9－11］，羅漢果醇能明顯下調(diào)A549細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)（P＜0.01），通過(guò)下調(diào)細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)了A549的凋亡。本研究表明，羅漢果提取物具有抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用，其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究分析。

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Apoptosis effect of Siraitia grosvenorii extracts on lung cancer cells A549 and its mechanisms

LIU Can1，2，CAI Tian-yu1，ZHAO Xiao-meng1，MA Lan-qing1，DOU De-quan1，SUN Yuan-xia2
［1．Key Laboratory of Urban Agriculture（North）of Ministry of Agriculture，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2．Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China］

Abstract：Aim To study the apoptosis effect of Sir-aitia grosvenorii extract on human lung cancer cells A549 and its mechanisms．Methods MTT assay was applied to determine A549 cell proliferation．Hoechst 33258 staining was applied to investigate morphological changes in A549 cells．To find out the cause of cell growth inhibition，several experiments on cell cycle distribution and apoptosis were performed by flow cy-tometry analysis．The expression of p21 and Bcl-2 was determined by Western blot．Results Flow cytometry analysis showed that treatment with mogrol arrested A549 cells in the G0／G1phase and induced apoptosis．After treatment with Siraitia grosvenorii extract，West-ern blot experiment showed cell cycle regulator p21 was up-regulaed，while the apoptosis inhibitor Bcl-2 was down-regulated．Conclusion Treatment with Siraitia grosvenorii extract arrests the A549 cells at G0／G1phase and induces apoptosis that may contribute to the anti-proliferation activity of mogrol through the regula-tion of p21 and Bcl-2 expression．

Key words：Siraitia grosvenorii；lung cancer cells A549；medicinal and edible；apoptosis；p21；Western blot

作者簡(jiǎn)介：劉 燦（1983－），男，博士，講師，研究方向：天然藥物，E-mail：liucan808＠163．com；竇德泉（1962－），男，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物、植物資源開(kāi)發(fā)，通訊作者，Tel：010-80799163，E-mail：doud-equan＠126．com；馬蘭青（1971－），男，博士，教授，研究方向：植物次生代謝產(chǎn)物生物合成分子調(diào)控與代謝，通訊作者，Tel：010-80797305，E-mail：lqma＠bac．edu．cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）資助項(xiàng)目（No 2012AA021403）；天津市企業(yè)博士后創(chuàng)新項(xiàng)目擇優(yōu)資助計(jì)劃項(xiàng)目（一等資助項(xiàng)目）

收稿日期：2015－04－09，修回日期：2015－05－29

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）09－1310－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．025