小鼠燒傷后時(shí)序芯片數(shù)據(jù)分析及免疫標(biāo)志物的初步篩選

高艷彬， 盧志陽， 金 輝， 史鵬偉， 王桂芳， 溫皇鼎， 楊 磊

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院燒傷科，廣東廣州510515）

小鼠燒傷后時(shí)序芯片數(shù)據(jù)分析及免疫標(biāo)志物的初步篩選

高艷彬1， 盧志陽1， 金 輝1， 史鵬偉1， 王桂芳1， 溫皇鼎1， 楊 磊1

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院燒傷科，廣東廣州510515）

目的：從基因轉(zhuǎn)錄水平探討燒傷早期免疫系統(tǒng)功能變化情況，并篩選燒傷后免疫相關(guān)標(biāo)志物，為臨床診療提供新思路.方法：GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE7404數(shù)據(jù)集（小鼠，25%TBSA，3度），共獲得32例基因表達(dá)譜數(shù)據(jù).應(yīng)用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)和倍比法（fold-change，F(xiàn)C）篩選差異表達(dá)基因（P-value＜0.01和｜lgFC｜＞1）.分別利用DAVID數(shù)據(jù)庫和STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物學(xué)過程功能富集分析及構(gòu)建免疫相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò).互作網(wǎng)絡(luò)的模塊及可視化分析應(yīng)用Cytoscape軟件進(jìn)行，并用BINGO插件進(jìn)行模塊功能分析.結(jié)果：在燒傷后第1 d的基因表達(dá)譜的變化最顯著，共1 825個(gè)差異基因被選出，其中上調(diào)基因658個(gè)，下調(diào)基因1 167個(gè).功能富集分析顯示刺激反應(yīng)和免疫系統(tǒng)過程等生物學(xué)功能貫穿整個(gè)燒傷早期.蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明LCK、CCR2、TLR2和MyD88等免疫相關(guān)基因可能在燒傷早期免疫功能變化過程中起著重要的作用.結(jié)論：利用生物信息學(xué)方法，分析燒傷后時(shí)序基因芯片數(shù)據(jù)，可以有效地揭示燒傷后免疫系統(tǒng)潛在的分子機(jī)制，可以為早期診斷和治療靶點(diǎn)的篩選提供新的思路.

燒傷； 免疫系統(tǒng)過程； 功能富集分析； 免疫相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

燒傷，尤其是嚴(yán)重?zé)齻麑⒁饳C(jī)體免疫功能紊亂，免疫功能紊亂被認(rèn)為是引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）、多器官功能障礙（MODS）甚至死亡等的重要原因［1］.燒傷后免疫功能的變化一直貫穿著燒傷治療全程，不僅引起全身非特異性免疫功能的變化，引發(fā)大量炎癥因子及細(xì)胞因子的釋放，并能造成全身特異性免疫功能的改變，引起體液免疫失調(diào)，細(xì)胞免疫功能受損［2］.

燒傷后免疫功能變化的過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，其病理生理學(xué)過程要受到燒傷面積，深度，年齡等多方面因素的影響，盡管燒傷后免疫功能的研究一直備受關(guān)注，但其確切的發(fā)生機(jī)制至今尚未明確.在2008年和2011年James A［3］和Wenzhong Xiao［4］等就分別利用基因芯片技術(shù)對(duì)小鼠和人創(chuàng)傷及燒傷后免疫細(xì)胞基因組的序貫性變化做出了初步探究，并發(fā)現(xiàn)了許多值得深思及顛覆性的信息，遺憾的是這些研究均著重于燒傷與創(chuàng)傷之間的對(duì)比，并無對(duì)燒傷后基因轉(zhuǎn)錄水平變化進(jìn)行深入的研究與分析.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用小鼠燒傷后免疫細(xì)胞時(shí)序基因芯片數(shù)據(jù)，對(duì)燒傷早期不同時(shí)間點(diǎn)的免疫相關(guān)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期從細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平了解燒傷后免疫功能變化情況，并篩選潛在的重要的生物學(xué)靶點(diǎn).

1 材料和方法

在美國生物技術(shù)信息中心GEO數(shù)據(jù)庫（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／）下載GSE7404［3］數(shù)據(jù)集.GSE7404數(shù)據(jù)集（小鼠，25%TBSA，三度燒傷）為GPL1261平臺(tái)Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array基因芯片.從中選取燒傷相關(guān)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，總共有32個(gè)樣本符合分析要求（包括16個(gè)燒傷和16個(gè)對(duì)照）.根據(jù)芯片注釋及處理情況進(jìn)行分組：燒傷后2 h組及其對(duì)照組、燒傷后1 d組及其對(duì)照組，燒傷后3 d組及其對(duì)照組，燒傷后7 d組及其對(duì)照組.

1.1 統(tǒng)計(jì)方法

芯片質(zhì)量評(píng)估、差異基因獲取及統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用開源統(tǒng)計(jì)軟件R3.01進(jìn)行（http：／／www.r-project.org）.通過對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行RMA（robust multiarray average）背景矯正、四分位數(shù)法進(jìn)行歸一化處理，并進(jìn)行匯總以獲取表達(dá)水平數(shù)據(jù)［5-6］.差異基因獲取采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)和倍比法（fold change，F(xiàn)C），選出P-value＜0.01和｜lgFC｜＞1的基因作為差異表達(dá)基因進(jìn)行下一步分析.

1.2 功能富集分析及原始蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

應(yīng)用DAVID［7］（Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery）（http：／／david.abcc.ncifcrf.gov／）網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫對(duì)所選出的差異基因進(jìn)行Gene Ontology（GO）［8］功能富集分析.選取EASE（Expression Analysis Systemic Explorer）＜0.05的生物學(xué)功能，并將差異表達(dá)基因根據(jù)功能富集結(jié)果進(jìn)行功能分類.原始蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建由DAVID及STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行.先將不同組的差異基因經(jīng)DAVID基因轉(zhuǎn)換工具（Gene ID Conversion Tool）進(jìn)行基因ID轉(zhuǎn)換；再將轉(zhuǎn)換后的基因通過STRING9.1［9］（functional protein association networks）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建原始蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-protein interaction network）并選取中等可信度的互作關(guān)系（交互作用評(píng)分大于0.4）進(jìn)入下一步分析.

1.3 免疫系統(tǒng)過程相關(guān)基因的選取及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將經(jīng)過Gene Ontology（GO）功能富集分析所選取的免疫系統(tǒng)過程相關(guān)基因（GO：0002376 immune system process）映射到各組的原始蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中構(gòu)建免疫相關(guān)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò).免疫相關(guān)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析及MCL網(wǎng)絡(luò)模塊分析采用生物圖表可視化工具Cytoscape軟件［10］進(jìn)行，并應(yīng)用BinGO2.44［11］對(duì)網(wǎng)絡(luò)模塊進(jìn)行Gene Ontology功能富集分析.

2 結(jié)果

2.1 功能富集分析及免疫系統(tǒng)相關(guān)差異基因獲取

共有2 725個(gè)差異基因符合P-value＜0.01和｜lgFC｜＞1，且表達(dá)量變化超過2倍標(biāo)準(zhǔn)（表1）.差異基因最顯著變化發(fā)生在燒傷后第1 d，有1 825個(gè)基因被選出，其中上調(diào)基因658個(gè)，下調(diào)基因1 167個(gè).

小鼠燒傷后不同組間基因功能富集（Gene Ontology）情況如表2所示，其中以燒傷后1 d組的變化最顯著，上調(diào)和下調(diào)差異基因同時(shí)富集在細(xì)胞過程，生物調(diào)節(jié)，代謝過程，免疫系統(tǒng)過程及刺激反應(yīng)等生物學(xué)功能中.通過對(duì)不同組間基因功能富集情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：免疫系統(tǒng)過程及應(yīng)對(duì)刺激反應(yīng)等生物學(xué)功能一直貫穿燒傷早期，說明燒傷后免疫系統(tǒng)過程在燒傷后起著十分重要的作用.

表1 燒傷早期不同時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)基因Table 1 Signature genes involved in time series stage of burn

表2 差異表達(dá)基因功能富集結(jié)果Table 2 Results of functional enrichment analysis for DEGs

2.2 免疫相關(guān)基因選取及蛋白網(wǎng)絡(luò)分析

為了進(jìn)一步了解燒傷早期免疫相關(guān)基因功能變化情況，我們將不同時(shí)間點(diǎn)的差異基因構(gòu)建原始蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并將免疫系統(tǒng)相關(guān)基因映射到網(wǎng)絡(luò)中構(gòu)建免疫相關(guān)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò).同時(shí)應(yīng)用Cytoscape軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行MCL網(wǎng)絡(luò)模塊化分析及應(yīng)用BinGO2.44對(duì)模塊進(jìn)行Gene Ontology功能富集分析（如圖2、表4）.

以LCK-CD48為中心的網(wǎng)絡(luò)模塊a（圖2-a）為燒傷后2h組免疫互作網(wǎng)絡(luò)經(jīng)MCL聚類分析所得，LCK、CD48、CD5，CD80，PTPN6等5個(gè)基因在網(wǎng)絡(luò)模塊a中擁有最大互作關(guān)系，功能富集分析顯示，其在免疫系統(tǒng)過程正性調(diào)節(jié)中起到重要的作用.

在燒傷后1 d組中原始蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及免疫相關(guān)差異基因映射情況如圖1所示.MCL富集分析顯示Traf6，Lck，Cd19，Tlr2，Myd88，Cd79a，Cxcr5，Ccr2等28個(gè)差異基因在網(wǎng)絡(luò)模塊b-f中具有最高互作關(guān)系（如表3）.功能富集分析顯示他們?cè)诠逃忻庖叻磻?yīng)，免疫系統(tǒng)正性調(diào)節(jié)，抗原處理和表達(dá)及防御反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用.

網(wǎng)絡(luò)模塊g為燒傷后3 d組MCL模塊分析所得，CCR2，MYD88，TLR4，TLR2，在模塊中處于中心位置，且擁有最大互作關(guān)系，且在炎癥反應(yīng)中有著重要作用.網(wǎng)絡(luò)模塊h-i為燒傷7 d組差異基因經(jīng)MCL分析所得，Tlr2，MYD88，Gp49a，Clec4n，AF251705等 14個(gè)基因擁有最大互作，并在固有免疫反應(yīng)中起著重要作用.

表3 燒傷后1 d組擁有最大互作關(guān)系的差異基因（前10）Table 3 The characteristics for the 10 genes in the network

圖1 燒傷后第一天原始蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及免疫相關(guān)基因（150個(gè)）映射情況.紅色為免疫系統(tǒng)過程上調(diào)基因，藍(lán)色為免疫系統(tǒng)過程下調(diào)基因Fig.1 The interaction network for the 150 immune related DEGs in the 1day post burn injury.The red dots represent up-regulated gene and blue dots down-regulated gene.The edges represent interaction.

圖2 經(jīng)MCL聚類分析后各組網(wǎng)絡(luò)模塊.a為燒傷后2小時(shí)組網(wǎng)絡(luò)模塊，b-f為燒傷后1天組網(wǎng)絡(luò)模塊，g為燒傷后3天組網(wǎng)絡(luò)模塊，h-i為燒傷后7天組網(wǎng)絡(luò)模塊.紅色為免疫系統(tǒng)進(jìn)程上調(diào)基因，藍(lán)色為免疫系統(tǒng)進(jìn)程下調(diào)基因.Fig.2 Clusters a-i and the top eight subnetworks in PPI network in detail.Red nodes represent genes upregulated and blue nodes represent genes downregulated.Cluster a was the subnetworks for 2 hour group post injury；cluster b-f were the subnetworks for 1day group post injury；cluster g was the subnetworks for3day group post injury and cluster h-1 were the subnetworks for7day group post injury.

表4 MCL網(wǎng)絡(luò)功能富集分析結(jié)果Table 4 The largest eight PPI subnetworks

3 討論

基因芯片作為一種高效、大規(guī)模獲取生物信息的技術(shù)，可以同時(shí)捕捉成千上萬的基因的動(dòng)態(tài)變化，現(xiàn)已經(jīng)廣泛地用于分子生物學(xué)研究中［12］.本研究應(yīng)用小鼠燒傷后免疫細(xì)胞時(shí)序芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析，通過選取免疫系統(tǒng)過程相關(guān)基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，篩選燒傷后免疫系統(tǒng)功能變化過程中可能起到關(guān)鍵作用的基因.通過分析我們發(fā)現(xiàn)Lck，Ccr2，TLR2和Myd88等基因可能在燒傷早期免疫功能紊亂發(fā)生、發(fā)展中起到關(guān)鍵性的作用.

功能富集分析顯示Lck（淋巴細(xì)胞蛋白酪氨酸激酶）作為燒傷后2 h組和1 d組的下調(diào)基因在燒傷后免疫系統(tǒng)正性調(diào)節(jié)過程中起到重要的作用（P值分別為5.8948E-11，2.8087E-6）.LCK基因編碼所產(chǎn)生p56（LCK），是非受體酪氨酸蛋白激酶致癌基因家族成員之一，表達(dá)于所有的T細(xì)胞譜系細(xì)胞中［13］.p56（LCK）蛋白錨定到細(xì)胞膜并與CD4／CD8共同受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用，并具有酪氨酸激酶活性［14］.質(zhì)膜上的Lck使得TCR復(fù)合中的信號(hào)模體磷酸化從而啟動(dòng)T細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，然后磷酸化的信號(hào)模體為TCR復(fù)合招募磷酸化的ZAP-70 PTK分子［15］.p56（LCK）是在絕大多數(shù)胸腺細(xì)胞發(fā)育過程中啟動(dòng)TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白酪氨酸激酶［16］，對(duì)成熟T細(xì)胞的選擇和成熟中發(fā)揮核心作用［17］.Lck可能在燒傷后T細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫功能中起著重要的作用.

CCR2是單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的特異的受體.CCR2在炎癥細(xì)胞表面普遍表達(dá).趨化因子MCP-1與CCR2特異性結(jié)合后可趨化多種炎癥細(xì)胞（單核、巨噬細(xì)胞、記憶和殺傷T淋巴細(xì)胞等）至炎癥病灶而發(fā)揮免疫作用［18］.實(shí)驗(yàn)表明CCR2缺乏可抑制MCP-1的基因表達(dá)，成纖維細(xì)胞積累和巨噬細(xì)胞浸潤降低TNF-α和IFN-γ基因表達(dá)［19］.同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)CCR2信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的生產(chǎn)［20］.CCR2分析顯示CCR2在燒傷后防御反應(yīng)及炎癥反應(yīng)中起著重要的作用，可能在燒傷后免疫細(xì)胞趨化作用及創(chuàng)面修復(fù)過程中起著中起著重要的作用.

TLR2和Myd88同時(shí)在燒傷后第1d組至第7 d組，功能富集分析顯示其在固有免疫反應(yīng)中起著重要的作用.其中，TLR2為Toll樣受體（TLRs）家族成員，為Ⅰ型跨膜蛋白受體，廣泛表達(dá)于先天免疫細(xì)胞中（如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞），可以識(shí)別細(xì)菌和病毒及相關(guān)物質(zhì)等外源性配體.Myd88（髓樣分化因子88）作為銜接蛋白在機(jī)體固有免疫應(yīng)答反應(yīng)中能直接參與到Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中［21］.TLR2是啟動(dòng)Myd88依賴性防御反應(yīng)的重要的模式識(shí)別受體，免疫細(xì)胞胞膜上的TLR2受體可特異性識(shí)別革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌的膜組件可以病原體，并啟動(dòng)Myd88依賴性防御反應(yīng)，并通過IRAK1，IRAK2和TRAF6［22］等作用可以通過快速激動(dòng)NF-κB和MAPK傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子（TNFα，IL-1β，IL-6，IL-12）的產(chǎn)生引發(fā)前炎性反應(yīng)并能上調(diào)共刺激分子（IL-8，RANTES，MIP-1α）的上調(diào)引發(fā)先天免疫的快速激活［23-24］.TLR2和Myd88在燒傷后可以通過Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路啟動(dòng)機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，使機(jī)體對(duì)入侵的病原體產(chǎn)生最適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答，從而維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定.

在本研究中，我們應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)小鼠燒傷后免疫細(xì)胞基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，并構(gòu)建免疫系統(tǒng)相關(guān)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò).通過互作網(wǎng)絡(luò)分析我們發(fā)現(xiàn)LCK，CCR2，TLR2，Myd88等基因在燒傷后免疫系統(tǒng)功能變化過程中可能起到關(guān)鍵作用.由于分析結(jié)果基于基因轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)所得，盡管我們應(yīng)用更嚴(yán)格的分析方法和工具來確保分析數(shù)據(jù)和結(jié)果的可靠性，但是仍需要一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)纳飳W(xué)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證分析結(jié)果是否適用于不同燒傷面積及深度.

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［責(zé)任編輯：孫升云 王景周］

Screening of biomarkers for immune system process with post burn injury time-course gene expression profiling data in m ice

GAO Yanbin1， LU Zhiyang1， JIN Hui1， SHI Pengwei1， WANG Guifang1，WEN Huangding1， YANG Lei1
（Department of Burns，Nanfang hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

Aim：Our study aims to deepen the understandings about the mechanisms of immune system process post-burn injury via screening relevant biomarkers with time-course gene expression profiling data in mice.Methods：Microarray data set GSE7404 was downloaded from GEO database，including 16 burn injury（Mus musculus，25% TBSA，full-thickness）and 16 controls.Student’s t test and fold change method were employed to identified differentially expressed genes with P＜0.01 and｜lgFC｜＞1.Then，we used DAVID to perform functional enrichment analysis to uncover dysfunctional biological processes.Immune related Protein-Protein interaction（PPI）network was constructed by STRING and visualized in Cytoscape.Functional analysis of the hub protein was performed by BinGO.Results：The maximumchange of gene expression profile was found at 1-days post injury a total of 658 up-regulated genes and 1167down-regulated genes were identified.The response to stimulus and immune system process were captured by gene expression signature through all time points.Protein-protein interaction network and module analysis suggested that some immune related genes，such as Lck，Ccr2，TLR2 and Myd88 could be of great value for further investigation.Conclusion：It could be inferred that understanding the underlying molecular mechanism post burn injury，may provide novel insight for development of therapeutics strategy.

post burn injury； immune system process； functional enrichment analysis； Immune related Protein-Protein interaction network

R644

A

1000-9965（2015）03-0275-07

10.11778／j.jdxb.2015.03.016

2014-12-08

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院院長基金（2014B013）

高艷彬（1988-），男，研究方向：燒傷危重病救治

楊 磊，副教授.Tel：020-61641841；E-mail：yuanyang＠fimmu.com