重組人硫氧還蛋白對大鼠內(nèi)毒素肺損傷保護(hù)作用

陳紅武， 趙海燕， 胡旭初

（1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院新生兒科，廣東廣州510515；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，廣東廣州510080）

重組人硫氧還蛋白對大鼠內(nèi)毒素肺損傷保護(hù)作用

陳紅武1， 趙海燕1， 胡旭初2

（1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院新生兒科，廣東廣州510515；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，廣東廣州510080）

目的：探討重組人硫氧還蛋白1（rhTrx-1）對新生SD大鼠急性內(nèi)毒素肺損傷的保護(hù)作用.方法：制備、鑒定rhTrx-1；將新生SD大鼠分為對照組、脂多糖（LPS）實(shí)驗(yàn)組和LPS＋rhTrx-1干預(yù)組.腹腔注射LPS（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 mg／kg），制備急性內(nèi)毒素肺損傷模型，干預(yù)組于LPS注射前30 min腹腔注射rhTrx-1（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 mg／kg），觀察注射后24 h各組新生SD大鼠的一般情況以及死亡率；重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每組分別于實(shí)驗(yàn)后的2、8 h隨機(jī)處死大鼠，提取肺組織用于病理切片觀察.結(jié)果：（1）成功制備rhTrx-1；（2）LPS組大鼠表現(xiàn)出活動(dòng)少，反應(yīng)差，精神萎靡，毛發(fā)無光澤，口周發(fā)紺等全身炎癥反應(yīng)癥狀，瀕死狀態(tài)時(shí)表現(xiàn)為毛色青灰，呼吸淺表；LPS＋hTrx-1干預(yù)組動(dòng)物癥狀明顯減輕；陰性對照組、LPS實(shí)驗(yàn)組和LPS＋rhTrx-1干預(yù)組大鼠24 h死亡率分別為0%，67%、17%（χ2＝14.400，P＝0.001）；（3）LPS組肺組織損傷嚴(yán)重，可見肺組織結(jié)構(gòu)不完整，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔內(nèi)有紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及漿液滲出，血管周圍組織可見白細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管有明顯充血及擴(kuò)張表現(xiàn)，隨時(shí)間延長有加重趨勢，LPS＋rhTrx-1干預(yù)組病理改變較內(nèi)毒素組明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)尚正常，輕度肺水腫，肺泡間隔稍增寬，紅細(xì)胞滲出明顯減少，肺泡及肺間質(zhì)中白細(xì)胞浸潤減少.結(jié)論：重組人硫氧還蛋白1對急性內(nèi)毒素肺損傷的新生大鼠具有保護(hù)作用.

重組人硫氧還蛋白1； 急性肺損傷； 新生SD大鼠

新生兒急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是高病死率的臨床重癥和急癥之一，近年研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激（oxidativestress，OS）在ALI的病理發(fā)展過程中扮演重要的角色［1］，炎癥和抗炎、氧化和抗氧化失衡的理論已被人們廣泛關(guān)注［2-3］.肺是炎癥反應(yīng)的重要靶器官之一，炎癥反應(yīng)會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷肺功能，導(dǎo)致呼吸障礙.硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）又稱白細(xì)胞介素-1樣細(xì)胞因子，普遍存在于生物體中［4-5］.近年國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，人硫氧還蛋白1與氧化應(yīng)激、炎癥性疾病關(guān)系密切［6］.本研究通過克隆和表達(dá)有酶活性的Trx，探討該重組蛋白對急性內(nèi)毒素肺損傷新生大鼠的保護(hù)作用，為后期其抗炎作用相關(guān)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

（1）rhTrx-1與動(dòng)物 ①人重組硫氧還蛋白（hTrx-1）cDNA的獲得、引物設(shè)計(jì)、基因擴(kuò)增 從人胎肝細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；從人cDNA文庫中篩選出hTrx-1基因，根據(jù)其編碼序列及原核載體PET-28a（＋）的多克隆位點(diǎn)，利用DNA Club設(shè)計(jì)引物，上游引物P1：5′-AGAGAGCTCATGTCTTCAGGAAATGCTAAA-3′，下劃線為SacI酶切位點(diǎn)，AGA為保護(hù)性堿基，下游引物P2：5′-TTTGTCGACCTTCTGCTTGGAGAAATA-TTC-3′，下劃線為Sal I酶切位點(diǎn)，TTT為保護(hù)性堿基.以cDNA為模板，應(yīng)用設(shè)計(jì)的特異引物，利用高保真的Ex TaqTM酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min，循環(huán)參數(shù)是95℃1 min，50℃1 min，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定回收.②hTrx-1基因的構(gòu)建和鑒定 將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）產(chǎn)物和重組質(zhì)粒PET-28a（＋）經(jīng)SacI和Sal I雙酶切后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素篩選陽性克隆，對陽性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切、PCR和測序鑒定.將驗(yàn)證正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌中.③hTrx-1的大量表達(dá)及純化 對陽性克隆進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，收集沉淀 、超聲裂解，參照His柱說明書，利用6×His的鎳離子親和層析柱進(jìn)行蛋白純化，收集蛋白洗脫液，透析后用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測定，并于-80℃保存?zhèn)溆?

（2）動(dòng)物與試劑 SPF級足月新生7 d SD大鼠（由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；脂多糖（LPS）（美國Sigma公司）

1.2 方法

（1）建立新生SD大鼠急性內(nèi)毒素肺損傷模型足月新生7 d SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，建立內(nèi)毒素急性肺損傷模型［4］，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 mg／kg LPS腹腔注射.

（2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 36只新生7 d大鼠逐一編號，按照隨機(jī)數(shù)字表分為陰性對照組、LPS實(shí)驗(yàn)組和LPS＋rhTrx-1干預(yù)組，各組12只，陰性對照組腹腔注射生理鹽水0.1 mL；LPS實(shí)驗(yàn)組腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 mg／kg LPS；LPS＋hTrx-1干預(yù)組于LPS注射前30 min腹腔注射rhTrx-1（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 mg／kg）.觀察注射后24 h各組大鼠的一般情況和死亡率.

（3）每組分別于實(shí)驗(yàn)后的2、8 h隨機(jī)處死3只，提取肺組織用于病理切片觀察.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，3組間死亡率比較采用多個(gè)樣本率χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 rhTrx-1全長基因及編碼序列

rhTrx-1基因全長為600 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼為TGA，編碼198個(gè)氨基酸.

2.2 rhTrx-1基因的擴(kuò)增和克隆

用特異性引物擴(kuò)增出hTrx-1基因，經(jīng)凝膠電泳檢測在600 bp附近有特異條帶，與理論值大小相符.將提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，測序結(jié)果表明插入序列與hTrx-1基因cDNA序列一致，上述結(jié)果說明重組原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，如圖1.

圖1 重組質(zhì)粒PET-28a（＋）-hTrx-1的PCR及酶切鑒定Fig.1 The identification of the PET-28a（＋）-hTrx-1 by PCR Amplification and digestion with restriction enzyme

2.3 蛋白表達(dá)純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21／DE3中進(jìn)行表達(dá)，SDS聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分析結(jié)果如圖2中所示，在25～35 kDa有表達(dá)條帶，與重組蛋白分子量27.9 kDa基本相符.對蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果如圖2中第7泳道，其位置與目的蛋白相符.測得純化產(chǎn)物的蛋白質(zhì)量濃度為1.2 mg／mL.

2.4 24 h各組新生大鼠的一般情況

陰性對照組大鼠活動(dòng)良好，反應(yīng)靈敏，飲食正常，毛發(fā)光澤，膚色紅潤；實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物注入LPS后，逐漸表現(xiàn)出活動(dòng)少，反應(yīng)差，精神萎靡，毛發(fā)無光澤，口周發(fā)紺等全身炎癥反應(yīng)癥狀，瀕死狀態(tài)時(shí)表現(xiàn)為毛色青灰，呼吸淺表；rhTrx-1干預(yù)組動(dòng)物癥狀較實(shí)驗(yàn)組明顯減輕.

圖2 重組質(zhì)粒PET-28a（＋）-hTrx-1在大腸埃希菌BL21／DE3的表達(dá)產(chǎn)物及其純化產(chǎn)物的12%SDS-PAGE電泳分析Fig.2 Expression and purification of recombinant CsTP21.1 in Escherichia coli BL21（DE3）identified by 12% SDSPAGE

2.5 各組新生大鼠死亡率比較

如表1所示數(shù)據(jù)，對3組間死亡率差異采用χ2檢驗(yàn)，對照組死亡率為0，實(shí)驗(yàn)組死亡率為67%，干預(yù)組死亡率為17%，各組死亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝14.400，P＝0.001），由此可以看出，rhTrx-1可明顯降低內(nèi)毒素急性肺損傷新生大鼠的死亡率，對新生大鼠具有保護(hù)作用.

表1 rhTrx-1對內(nèi)毒素急性肺損傷新生大鼠的存活率的影響Table 1 Effect of rhTrx-1 on the survival rate of neonatal rats treated with acute lung injury

2.6 肺組織大體觀察

實(shí)驗(yàn)組在LPS腹腔注射后，新生大鼠肺臟即可見點(diǎn)狀肺出血，給藥后1～8 h出血程度由局灶到彌漫，逐漸加重.與實(shí)驗(yàn)組相比，干預(yù)組的新生大鼠肺臟出血程度明顯減輕.

2.7 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)組肺組織損傷嚴(yán)重，鏡下可見肺組織結(jié)構(gòu)不完整，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔內(nèi)有紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及漿液滲出，血管周圍組織可見白細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管有明顯充血及擴(kuò)張，隨時(shí)間延長有加重趨勢（如圖3和圖5分別為LPS注射后2 h及8 h）.干預(yù)組病理改變較內(nèi)毒素組明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)尚正常，輕度肺水腫，肺泡間隔稍增寬，紅細(xì)胞滲出明顯減少，肺泡及肺間質(zhì)中白細(xì)胞浸潤減少（如圖4和圖6分別為rhTrx-1干預(yù)后2 h及8 h）.陰性對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，肺泡間隔無水腫，間質(zhì)及肺泡內(nèi)見極少紅細(xì)胞及炎癥細(xì)胞浸潤（如圖7）.

圖3 實(shí)驗(yàn)組2 h HE染色×400Fig.3 2 h in LPS group staining of hematoxylin and Eosin×400

圖4 干預(yù)組2 h HE染色×400Fig.4 2 h in rhTrx-1 group staining of hematoxylin and Eosin×400

圖5 實(shí)驗(yàn)組8 h HE染色×400Fig.5 8 h in LPS group staining of hematoxylin and Eosin×400

圖6 干預(yù)組8 h HE染色×400Fig.6 8 h in rhTrx-1 group staining of hematoxylin and Eosin×400

圖7 陰性對照組HE染色×400Fig.7 Control group staining of hematoxylin and Eosin×400

3 討論

肺是內(nèi)毒素最常累及靶器官，由于ALI導(dǎo)致機(jī)體缺氧、酸中毒和呼吸衰竭，死亡率高達(dá)40%～70%，當(dāng)合并其他臟器損害時(shí)病死率會(huì)顯著提高，是臨床上常見的高死亡率疾病.ALI是多種致病因素導(dǎo)致的肺組織結(jié)構(gòu)和功能的損傷，以肺部微血管和肺泡上皮彌漫性損傷、肺水腫及肺間質(zhì)纖維化等臨床綜合征，嚴(yán)重者可發(fā)展為死亡率極高的ARDS.ALI發(fā)病的根本原因是肺內(nèi)過度失控的炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、細(xì)胞凋亡、血管緊張素系統(tǒng)參與了的氧化抗氧化失衡等［7］.因此，抑制體內(nèi)過激的炎癥反應(yīng)和氧化反應(yīng)是防治ALI的關(guān)鍵.近年國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，Trx與氧化應(yīng)激、炎癥性疾病關(guān)系密切，但給予外源性的Trx是否對感染或缺氧導(dǎo)致的ALI具有保護(hù)作用尚未見報(bào)道.

Trx于1964年由Reichard首次發(fā)現(xiàn)，除具有基本的抗氧化功能外，還具有促生長、抗凋亡、抗炎和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性等作用［8］.在急性肺損傷患者中，胞外Trx的水平與細(xì)胞因子IL-8呈正相關(guān)性，胞外Trx的水平可作為疾病炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的判斷指標(biāo)［9］.在急性肺損傷患者中，患者血漿、支氣管肺泡灌洗液（BAL）、肺巨噬細(xì)胞及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中Trx的含量顯著增加.腹腔注射重組人Trx-1可減弱博萊霉素或炎癥因子IL-2和lL-18引起的間質(zhì)性肺炎和肺纖維化［10］，這提示外源性重組人Trx-1的適當(dāng)補(bǔ)充可增強(qiáng)其抗炎作用，對機(jī)體組織及臟器等具有保護(hù)作用.LPS是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分，本研究中LPS注射后大鼠出現(xiàn)ALI，肺組織損傷嚴(yán)重，肺出血明顯，光鏡下可見肺組織結(jié)構(gòu)不完整，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔內(nèi)有紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及漿液滲出，血管周圍組織可見白細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管有明顯充血及擴(kuò)張表現(xiàn)，隨時(shí)間延長，損傷有加重趨勢.但給予外源性rhTrx-1干預(yù)后，內(nèi)毒素急性肺損傷大鼠24 h死亡率明顯降低，肺出血顯著減輕，肺組織病理形態(tài)觀察提示紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的滲出及浸潤減少，肺部炎癥反應(yīng)減輕，急性肺損傷的病理進(jìn)程被阻斷，這些均證實(shí)補(bǔ)充外源性rhTrx-1對內(nèi)毒素導(dǎo)致急性肺損傷新生大鼠也具有保護(hù)作用.

給予外源性rhTrx-1能減少內(nèi)毒素作用后新生大鼠的死亡，抑制肺組織的炎癥反應(yīng).可能與其對于炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子NF-κB有一定的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，通過抑制氧化劑，提高DNA和NF-κB的連接，活化NF-κB，從而調(diào)控炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和激活，Trx的這種還原作用比L—Cys和還原型谷胱甘肽的作用更為強(qiáng)烈［11］.胞外Trx除了調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌、表達(dá)及釋放外，它還具有調(diào)節(jié)炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的作用，如能抑制P38有絲分裂原蛋白激酶的活性［12］，參與對炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如轉(zhuǎn)錄激活因子（AP-1）、核因子κB（NF-κB）、糖皮質(zhì)激素受體的調(diào)節(jié)，抑制巨噬細(xì)胞遷移、抑制因子MIF（一種促炎因子）的活性與釋放［11］等.Trx對于各種還原酶系統(tǒng)都有顯著調(diào)節(jié)作用，例如超氧化物歧化酶（superoxidasedimutase，SOD），從而能抵抗體內(nèi)的氧化反應(yīng).因此，Trx能抑制過激的炎癥反應(yīng)和氧化反應(yīng)，起到保護(hù)臟器免受損害的作用

本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，給予外源性rhTrx-1能抑制內(nèi)毒素造成的過激炎癥反應(yīng)和氧化反應(yīng)，抑制單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞到達(dá)炎癥反應(yīng)部位，進(jìn)而抑制促炎因子的表達(dá)和釋放，減輕炎癥反應(yīng)及炎癥損傷.胞外Trx具有抗炎特性及對過激炎癥導(dǎo)致臟器損害的保護(hù)作用.因此，許多研究者開始合成rhTrx-1，進(jìn)一步明確其抗炎效果以及相關(guān)機(jī)制，期待可以用于臨床，治療炎癥類疾病.

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［責(zé)任編輯：陳詠梅］

Protective effect of recombinant human thioredoxin-1 on LPS-induced acute lung injury of neonatal rats

CHEN Hongwu1， ZHAO Haiyan1， HU Xuchu2
（1.Department of Neonatology，the Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2.Department of Parasitology，the Zhongshan Medical College，Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510080，China）

Aim：To study the protective effects of recombinant human thioredoxin-1 on LPS-induced acute lung injury of neonatal rats.Methods：Prepare recombinant human thioredoxin-1 and then prepare animal model of LPS-induced acute lung injury of newborn rats.The full-term newborn Sprague-Dawley rats aged seven days were randomly divided into three groups-negative control group，LPS group and rhTrx-1 intervention group.The rats of rhTrx-1 group were received intraperitoneal injection with rhTrx-1 10 milligram per kilogram，and then with LPS 5 milligram per kilogram in the same way half an hour later，while LPS group were received intraperitoneal injection with LPS 5 milligram per kilogram，negative control group with 0.9%saline 0.1 m l.Their general state and mortality of24 hour were observed.The lung morphology of 2 hour and 8 hour was observed by hematoxylin-eosin stain.Results：1.The prepara-tion of rhTrx-1 was successful.2.In the negative control group，everything was normal，no deaths occurred.In the LPS group，rats gradually showed a decrease in activity，drowsiness，perioral cyanosis，shortness of breath and some systemic inflammatory response symptoms after LPS injected.It turned grey in the skin and they had shallow breathing when they were moribund.The mortality was 67%.In rhTrx-1 group，the general condition of rats were obviously better than that of the control group.The mortality was 17%.The differences among the three groups had statistical significance.3.In the negative control group，the structure of the lung tissue was complete and there was no edema in alveolar septum.In LPS group，the structure of the lung tissue was incomplete and alveolar septum widened.There were a large number of red blood cells，inflammatory cells and serous exudates in the alveolar.Leukocyte infiltration，capillary hyperemia and expansion was visible in perivascular tissue.Compared with LPS group，pathological change was significantly reduced in the rhTrx-1 group.The edema was mild，alveolar septum widened slightly.Also，the leakage of red blood cell and the infiltration of leukocyte reduce significantly.Conclusion：The rhTrx-1 protein has protective effects on LPS-induced acute lung injury of neonatal rats.

recombinant human thioredoxin-1； acute lung injury； neonatal rat

R365.563

A

1000-9965（2015）03-0256-05

10.11778／j.jdxb.2015.03.012

2015-03-13

廣東省科技計(jì)劃基金項(xiàng)目（2012B031800140）

陳紅武（1966-），主任醫(yī)師，研究方向：新生兒危重癥

陳紅武，女，主任醫(yī)師，Mobile：13682257393；E-mail：13682257393＠163.com