貂圓環(huán)病毒感染的分子流行病學研究

王玉瑩，劉 曄，連 海，李 楠，張樂萃，扈榮良

（1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，山東 青島 266109；2.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林 長春 130122）

貂圓環(huán)病毒（Minkcircovirus，MiCV）是我國最近發(fā)現(xiàn)的一種引起傳染性水貂腸炎的新病原，臨床感染以紅白痢為主要特征，俗稱“頑固性腸炎”。貂圓環(huán)病毒性腸炎最早于20世紀70年代末在大連地區(qū)流行，目前國內(nèi)多地的養(yǎng)貂場均發(fā)現(xiàn)類似病例，在年輕貂群的感染率高達70%～80%。雖然該病致死率較低（7%～8%），但嚴重影響毛皮質(zhì)量，而且尚無疫苗和特效藥物[1]。因此，本研究在2013年9月至2014年9月，先后從山東諸城、河北饒陽和遼寧大連收集患腸炎水貂樣品，通過PCR檢測，對貂圓環(huán)病毒的感染情況和病毒核酸序列進行了分析，明確該病在我國的流行情況和病毒演化特征，為盡快研制針對性強的防治藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 從2013年9月到2014年9月，在山東諸城、遼寧大連、河北饒陽3個地區(qū)主要的規(guī)?；B(yǎng)殖場收集病貂樣品185份（主要包括水貂尸體65份和肛拭子120份）（表2）。

1.2 主要試劑和儀器 體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒（批號：04114kc5），質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒（批號：04314KA1），DNA凝膠回收試劑盒（批號：KE10120701-G），均購自康寧生命科學（吳江）有限公司。預染型PCR預混反應液（批號：A140A），pMD18-T（批號：K6701AB），均購自寶生物工程（大連）有限公司。

TGRANDIENTPCR儀，購自HYBAID公司。DYFⅢ2型電泳儀，購自Bio-Rad公司。UVI firereader XS凝膠成像系統(tǒng)，購自廣州市華奧行儀器有限公司。1.3 檢測方法 應用本實驗室建立的水貂圓環(huán)病毒PCR檢測方法，引物序列為F：5′-ATGCCCG?TAAGATCGCGAT-3′；R：5′-GGTACCTTAAGTTT?GCTTTGGG-3′，能夠擴增貂圓環(huán)病毒Cap全基因，對采集自我國山東、河北和遼寧3個地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場水貂樣品進行檢測。根據(jù)設計引物，可以獲得陽性樣品水貂圓環(huán)病毒基因Cap序列，貂圓環(huán)Cap全基因序列大小為684 bp。

1.4 克隆測序與序列分析 按照1.3的方法，于山東、河北、遼寧每個地區(qū)陽性病料進行檢測，選取一份陽性PCR產(chǎn)物進行回收，與pMD18-T克隆載體16℃連接過夜后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于氨芐青霉素抗性的細菌培養(yǎng)皿上37℃培養(yǎng)12 h后挑去單個菌落，37℃、200 r/min振蕩過夜，取2mL菌液按方法1.3進行PCR鑒定，挑選陽性重組質(zhì)粒送吉林省庫美生物科技有限公司進行測序，序列分析用DNAMAN軟件。

1.5 系統(tǒng)演化分析 將本實驗所獲得的3株毒株序列與GenBank中現(xiàn)有的圓環(huán)病毒屬成員序列，應用MEGA4[2]進行系統(tǒng)演化分析?；蛐蛄行畔碓匆姳?。

2 結果

2.1 病料的PCR擴增 所獲得的185份病貂樣品，山東地區(qū)陽性率為44.4%，河北地區(qū)陽性率為63.2%，遼寧地區(qū)陽性率為54.0%，總陽性率為54.6%（表2）。根據(jù)不同季節(jié)采集樣品結果顯示，2014年5月份采集自遼寧大連的4份肛拭子糞便樣品檢測全部為陰性；2014年6月份采集自山東諸城的5份肛拭子糞便樣品全部為陰性；2014年8月份采集自河北的5份肛拭子糞便樣品全部為陰性。陽性樣品檢出率較高的時間主要集中于9～10月份，且陽性樣品病貂均有腹瀉癥狀。

2.2 基因序列的測定與分析 所獲得的3個地區(qū)陽性樣品測序結果顯示，山東地區(qū)與遼寧地區(qū)擴增的Cap全基因完全相同，序列大小為684 bp，為貂圓環(huán)病毒Cap全基因；河北地區(qū)陽性結果與其他地區(qū)貂圓環(huán)病毒Cap全基因相比，只有3個堿基發(fā)生變化，但不同地區(qū)基因編碼的氨基酸仍然一致（圖1）。

2.3 系統(tǒng)演化分析 將新分離獲得的兩株圓環(huán)病毒Cap基因與GenBank中已經(jīng)登錄的不同種圓環(huán)病毒Cap基因序列進行演化分析，進化樹顯示，水貂圓環(huán)病毒與分離自菊頭蝙蝠的圓環(huán)病毒最相近[3]，其同源性為73%（圖2）。

表1 本文所用的基因序列信息

表2 2013年9到2014年9月收集樣品信息及檢測結果

圖1 山東、河北和遼寧3地區(qū)分離株貂圓環(huán)病毒Cap全基因編碼氨基酸比對結果

圖2 水貂圓環(huán)病毒與其他圓環(huán)病毒系統(tǒng)演化分析

3 討論

圓環(huán)病毒過去一直被列為未分類的病毒,是所有已知動物病毒中最小的[4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，圓環(huán)病毒呈高度流行，在世界不同地理區(qū)域廣泛分布。貂圓環(huán)病毒（Minkcircovirus，MiCV）是我國長春軍事獸醫(yī)研究人員于2013年發(fā)現(xiàn)的一種新的哺乳動物圓環(huán)病毒[1]。

根據(jù)調(diào)查結果，所有陽性水貂樣品，水貂都伴隨腹瀉，根據(jù)病程表現(xiàn)為白痢、黃痢和紅痢，繼而出現(xiàn)黑色血便，口鼻蒼白，最終死亡。根據(jù)檢測結果顯示，水貂圓環(huán)病毒在我國規(guī)?；B(yǎng)貂場的感染率為54.6%，需要引起重視。目前，沒有疫苗可以預防本病，不同地區(qū)曾接種自家苗來預防此病，但容易受貂阿留申病毒[5]感染帶來的不良影響。

根據(jù)序列分析結果顯示，山東地區(qū)水貂圓環(huán)病毒Cap基因與大連地區(qū)完全相同，沒有堿基突變，而河北地區(qū)僅有幾個堿基變化，堿基的變化并沒有導致氨基酸發(fā)生突變。實地調(diào)查結果證實，山東很多地區(qū)貂場都從大連進行調(diào)種，這是導致本病傳播的因素，并且進一步揭示了水貂圓環(huán)病毒在我國不同地區(qū)流行一致性。系統(tǒng)演化分析表明，該病毒與蝙蝠圓環(huán)病毒同源性最近，與其他圓環(huán)病毒親緣關系較遠，這是新發(fā)現(xiàn)的哺乳動物圓環(huán)病毒之一，根據(jù)比對結果可以證明該病毒為新的種。目前對于該病毒研究還處于初級階段，對病毒的致病機理和預防措施需要進一步研究。

同時，我們需要對全國不同地區(qū)養(yǎng)貂場養(yǎng)殖狐貍和貉子以及養(yǎng)殖人員也進行此種圓環(huán)病毒的檢測，以對本病做更全面了解。

[1]Lian H，Liu Y，Li N，etal.Novel Circovirus from Mink,China[J].Emerging Infectious Diseases，2014，9（20）:1548-1550.

[2]Tamura K，Nei M，Kumar S.Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method[J].PNAS，2004，101：11030-11035.

[3]He B，Li Z，Yang F，etal.Virome profiling of bats from Myanmar by metagenomic analysis of tissue samples reveals more novel mammalian viruses[J].PLoSONE，2013，8：e61950.http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0061950.

[4]Hughes A L，Piontkivska H.Nucleotide sequence polymorphism in circoviruses[J].InfectGenet Evol，2008，8：130-138.

[5]Elisabeth G，Soren A，Anders C，etal.Nucleotide sequence anal?ysis of aleutian mink disease parvovirus shows thatmultiple virus types are present in infected mink[J].Journal of Virology，1991，65（8）：4378-4386.