內(nèi)蒙古和新疆兩地草原革蜱源性馬駑巴貝斯蟲病病原DNA檢測

敖敦格日勒，格日勒圖，朱玉濤，巴音查汗

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018 ；2.新疆農(nóng)業(yè)大學動醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830052）

駑巴貝斯蟲病是由駑巴貝斯蟲（Babesia caball）寄生于馬屬動物紅細胞內(nèi)所引起的蜱傳性血液原蟲病。其臨床表現(xiàn)為高熱、貧血、黃疸、出血和呼吸困難等重劇癥狀，其急性病例死亡率高，對馬（包括所有馬屬動物）產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展影響極大。內(nèi)蒙古和新疆省等我國西北地區(qū)當前的馬產(chǎn)業(yè)(已成了朝陽產(chǎn)業(yè))正在向現(xiàn)代馬產(chǎn)業(yè)方向發(fā)展，馬屬動物則是在實際生產(chǎn)和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中占主導地位。駑巴貝斯蟲病的存在、流行與傳播媒介蜱的孳生和消長密切相關，具有一定的地區(qū)性和季節(jié)性。根據(jù)文獻記載，有3 個屬的14 種蜱可傳播駑巴貝斯蟲病，即革蜱屬、璃眼蜱屬和扇頭蜱屬[1]。媒介蜱傳播馬梨形蟲病十分廣泛，其危害相當嚴重。近年來駑巴貝斯蟲病的流行呈上升趨勢，為降低對馬屬動物養(yǎng)殖業(yè)的危害，故對駑巴貝斯蟲病的發(fā)病時間、流行規(guī)律及與媒介蜱的關系的掌握就顯得尤為重要。

本文對來自內(nèi)蒙古某地和新疆和靜縣牧區(qū)采集的蜱蟲進行了種屬鑒定，并探究所采集蜱蟲是否攜帶駑巴貝斯蟲病原。對鑒定后的兩地草原革蜱研磨后提取組織DNA，借助Bc48 基因設計特異性引物并進行PCR 擴增，檢測出了草原革蜱所攜帶的蜱源性駑巴貝斯蟲病病原。為其作為了解駑巴貝斯蟲病在這兩個地區(qū)的流行情況及綜合防治提供科學依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 樣品來源 分布于內(nèi)蒙古的草原革蜱，采自于內(nèi)蒙古西部的某地區(qū)147 只（2014 年3 月）；分布于新疆的草原革蜱，2014 年4 月采自新疆和靜縣部分山區(qū)200 只。

1.2 所采集蜱蟲的處理及鑒定 蜱的鑒定和形態(tài)描述：對以上兩地采到的蜱進行清洗處理,先從外部特征上初步分類,然后借助光學顯微鏡和有關資料[2-7]進行分類鑒定。

掃描電鏡樣品制備和電鏡觀察：將已鑒定的蜱制成掃描電鏡樣品，即固定、沖洗、脫水、KQ5200 型超聲波清洗器清洗，臨界點干燥法干燥、粘樣品、鍍金，然后在掃描電鏡下觀察并拍照。

1.3 蜱源性駑巴貝斯蟲DNA提取 先將清洗處理后的草原革蜱研磨；利用購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司的DNA提取試劑盒（均購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司），按其說明書進行提取蜱蟲基因組DNA。提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 診斷性PCR 引物設計 參考駑巴貝斯蟲Bc48 基因序列設計了1 對引物，其中駑巴貝斯蟲的上游引物為5′-GCGACGTGACTAAGACCTTATTGG-3′；下游引物為：5′-GTTCTCAATGTCAGTAGCATCCGC-3′。擴增駑巴貝斯病原長為452 bp 的特異性片段。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.5 PCR 反應體系、反應條件及產(chǎn)物檢測 PCR 擴增試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司。PCR 擴增的反應體系為：體系總體積25 μL，其中Mix 12.5 μL，上下游引物（umoL/L）各1 μL，DNA模板2 μL，滅菌去離子水補足至25 μL。PCR 擴增條件：94 ℃變性1 min，35 個循環(huán)擴增（94 ℃，30 s；56 ℃，45 s；72 ℃，1 min），72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

2 試驗結(jié)果

2.1 草原革蜱形態(tài)學鑒定 在光學顯微鏡下，草原革蜱主要形態(tài)特征：假頭基矩形，有琺瑯彩，頸溝前端深陷，眼較突出，位于盾板前側(cè)緣，氣門板逗點狀，達不到盾板邊緣。

表1 草原革蜱在掃描電鏡下的形態(tài)特征

在掃描電鏡下，草原革蜱主要形態(tài)特征：孔區(qū)較大，卵圓形向外斜置（見圖1A）。須肢第二節(jié)背后緣有細小的短刺（見圖1A）。齒式3|3（見圖1B）。氣門板逗點狀（見圖1C），無幾丁質(zhì)增厚部?；?jié)I 外距短于或等于內(nèi)距之長，基節(jié)IV向后方顯著伸長，其外距不超過該節(jié)后緣（見圖1C）。采自于兩地的草原革蜱形態(tài)基本相似。

圖1 草原革蜱

2.2 蜱源性駑巴貝斯蟲的PCR 檢測結(jié)果 提取了采自于內(nèi)蒙古西部某地的草原革蜱（N=147 只）和新疆和靜縣山區(qū)草原革蜱（N=200 只）共347 只蜱蟲唾液與血淋巴DNA，并對蜱源性DNA樣品進行PCR 檢測，檢測結(jié)果得到了與預期相同大小的452 bp 特異性陽性條帶，見圖2。表明了該種屬媒介蜱蟲攜帶駑巴貝斯蟲，可估測是當?shù)貍鞑ヱR駑巴貝斯蟲的主要媒介蜱種。

圖2 內(nèi)蒙古、新疆兩地部分草原革蜱源性駑巴貝斯蟲PCR樣品檢測結(jié)果

2.3 采自于內(nèi)蒙古、新疆兩地草原革蜱攜帶駑巴貝斯蟲的陽性率 在被檢測347 份疑似蜱蟲中，內(nèi)蒙古某地區(qū)草原革蜱攜帶駑巴貝斯蟲陽性數(shù)為12 份，新疆地區(qū)草原革蜱攜帶駑巴貝斯蟲陽性樣品為27 份（見表2）。由此得出內(nèi)蒙古西部地區(qū)草原革蜱攜帶駑巴貝斯蟲的陽性率為8.16%，新疆地區(qū)草原革蜱攜帶駑巴貝斯蟲的陽性率為13.50%，表明內(nèi)蒙古和新疆所采集到草原革蜱的區(qū)域均存在駑巴貝斯蟲。

表2 駑巴貝斯蟲病感染情況

3 討論與分析

草原革蜱是馬駑巴貝斯蟲病的主要傳播媒介之一，通常分布于牧區(qū)草原。草原牧區(qū)的媒介蜱叮咬馬屬動物導致發(fā)生駑巴貝斯蟲病。因此，通過提取蜱源性駑巴貝斯蟲DNA來推測、判斷馬駑巴貝斯蟲病是至關重要的。經(jīng)本試驗鑒定了采自于內(nèi)蒙古和新疆某些地區(qū)的草原革蜱，發(fā)現(xiàn)兩地均分布同一種蜱種-草原革蜱，其在形態(tài)結(jié)構(gòu)基本相似，據(jù)掃描電鏡觀察其假頭基、孔區(qū)、氣門板、基節(jié)內(nèi)外距、齒式等形態(tài)學特征，可作為其鑒別的依據(jù)；經(jīng)PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，同一種蜱的分布區(qū)域不同，其攜帶病原的陽性率也不同,這符合郝廣福等[8]的分析，即不同的地理生態(tài)條件和種屬特異性可能是形成這些感染格局的主要原因。

我國關于該病方面有些報道，羅金等[9]通過PCR 方法測得馬血液駑巴貝斯蟲病的陽性率為26.67%；沈丹等[10]采用酶聯(lián)免疫吸附試驗和涂片鏡檢的方法對廣州地區(qū)的馬屬動物進行了馬梨形蟲病調(diào)查的結(jié)果為1.9%；龔珍麗等[11]通過建立的駑巴貝斯蟲病間接ELISA檢測出駑巴貝斯蟲病的陽性率為17.6%（3/17），各地區(qū)馬感染該病的感染率均存在差異[12-13]。本試驗是通過特異性引物和PCR 擴增，得出了該種蜱攜帶的病原特異性DNA陽性條帶。即內(nèi)蒙古和新疆兩地的草原革蜱攜帶駑巴貝斯蟲的陽性率分別為8.16%、13，50%。因此，這兩個地區(qū)養(yǎng)殖農(nóng)戶應該提高防蜱意識，加強對馬駑巴貝斯蟲病的預防與治療工作的同時，加強媒介蜱蟲-草原革蜱的預防措施，保障馬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

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