張家口地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌的分離鑒定及中藥抑菌試驗

王海鳳

（河北北方學院動物科技學院，河北 張家口 075000）

近年來，張家口地區(qū)奶牛業(yè)生產(chǎn)態(tài)勢良好，帶動了地方經(jīng)濟的快速發(fā)展，但奶牛生殖系統(tǒng)疾病也隨之增多，其中子宮內(nèi)膜炎占相當大比例，嚴重影響了奶牛的繁育性能和產(chǎn)奶量，嚴重者可因喪失經(jīng)濟價值而被淘汰，給養(yǎng)殖戶造成的危害非常嚴重，經(jīng)濟損失巨大。

國內(nèi)外學者對患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮內(nèi)菌群的分離鑒定研究表明，引起子宮內(nèi)膜炎的主要原因是病原微生物的感染[1]。包括細菌、真菌、支原體、病毒和寄生蟲等。臨床上多使用抗菌藥物進行治療，由于耐藥菌株不斷產(chǎn)生，不但療效不佳，而且導致用藥量越來越大，后者又使治療成本增加，還會引起乳產(chǎn)品中藥物殘留超標、帶來食品安全隱患。中藥在治療奶牛疾病方面具有巨大的潛力，在奶牛飼料中應盡量添加中藥飼料添加劑，對影響牛奶質(zhì)量的主要疾病要進一步推廣中藥防治。

由于本病病原菌的種類隨地域不同而有較大差異，張家口及其周邊地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病率及主要致病菌缺乏相關資料，給臨床防治奶牛子宮內(nèi)膜炎造成很大難度。本試驗針對在張家口地區(qū)采集了疑似病例的奶牛子宮30 份（將30頭疑似病牛屠宰后取出整個子宮）進行主要病原菌的分離和鑒定，確定患病奶牛發(fā)生子宮內(nèi)膜炎后主要致病菌，然后測定中藥對分離菌株的體外抑制作用，篩選治療奶牛子宮內(nèi)膜炎敏感性的藥物，為有針對性地制定本地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的防治措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 中藥制備 中藥黃芩、硼砂、連翹、蒲公英、淫羊藿、益母草、紅花、當歸、金銀花、板藍根、苦參、夏枯草等，購自張家口華佗藥房。

中藥煎液制備：各中藥用水浸泡12 h 后，將以上每種單藥加蒸餾水至中藥完全浸沒，置于電爐上急火煮沸，沸騰后開始計時，文火煎熬30 min后倒出藥汁，再加水同樣煮沸1 次，將兩次的煎液混到一起，紗布過濾后濃縮至20 mL，制成含藥量為1 g/mL 的煎劑，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病料采集 按照臨床型奶牛子宮內(nèi)膜炎的診斷標準，在張家口壩上地區(qū)屠宰場將送去久配不孕即將淘汰的奶牛選出30 頭，經(jīng)過問診和直腸檢查暫定為子宮內(nèi)膜炎。奶牛屠宰后立即將子宮整體取出并采集子宮分泌物送實驗室進行病原菌培養(yǎng)鑒定。

1.3 病原菌分離鑒定 將采集的子宮分泌物逐個接種于肉湯培養(yǎng)液，37 ℃增菌培養(yǎng)24 h；然后將增菌培養(yǎng)液劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；挑取單菌落在普通瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離、培養(yǎng)。如此反復，直到培養(yǎng)基上的菌落特征相同時，再挑取單個菌落涂片，革蘭染色后鏡檢；根據(jù)菌落形態(tài)、菌體大小和染色特征，分別接種于鮮血培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)，然后將菌株分別接種于血瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、S.S.瓊脂培養(yǎng)基等鑒別培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)。長好后用塑料袋裝好密封放于4 ℃冰箱中保存，進行細菌的生化鑒定。菌種的保存則用含20%甘油的肉湯冷凍，-70 ℃保存。

將分離到的菌株逐個進行生化反應試驗[2]，主要包括以下幾方面試驗內(nèi)容：革蘭染色、溶血性、形態(tài)觀察、糖發(fā)酵試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗（M.R.試驗）、乙酰甲基甲醇試驗（V-P 試驗）、硝酸鹽還原試驗、硫化氫試驗。最后根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色、鏡檢結(jié)果和生化反應結(jié)果綜合分析，鑒定各菌株。具體細菌的鑒定參照《常見革蘭陽性菌的簡易鑒定方法》、《伯杰細菌鑒定手冊》和《臨床細菌學》中的細菌分群方法進行。

1.4 中藥抑菌試驗 采用平板打孔法[3]。分別取稀釋待測菌液于少量生理鹽水中制成0.5 號麥氏標準菌液，用滅菌棉球?qū)⒋龣z細菌混懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基表面，再用直徑5 mm 的無菌打孔器在每個平皿內(nèi)均勻打5 個孔，挑去孔內(nèi)瓊脂，火焰加熱封底后注入各中藥液，以剛剛注滿為準，37 ℃培養(yǎng)18～24 h 后，測定抑菌圈直徑。對于抑菌圈直徑過大的或是沒有的進行補做。

判斷標準：由于目前沒有關于中藥抑菌圈直徑同藥物敏感性的關系，所以具體抑菌試驗結(jié)果只能用抑菌圈直徑表示，根據(jù)國家藥政管理局1995 年制定的中新藥申報指南中規(guī)定，中藥采用打孔法，中藥的抑菌圈直徑超過8 mm 者可判定為抑菌作用。

2 結(jié)果

2.1 患病奶牛病原分布和感染情況 本試驗對30 個奶牛子宮分泌物進行細菌分離，共分離出6種主要病原菌，93 株，分別為大腸桿菌，葡萄球菌，鏈球菌，分泌屬化膿菌，蠟樣芽孢桿菌，沙門菌。單一感染和混合感染同時存在，混合感染高于單一感染（表1）。試驗表明，葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌。且從病料來源看（30 頭淘汰奶牛全部來自張家口市壩上周邊地區(qū)），該結(jié)論可以代表張家口市壩上周邊地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的真實性。

表1 病原菌各分離菌株的種類及部分特性

2.2 病原培養(yǎng)特性、染色特性和生化鑒定 經(jīng)無菌方式采取的不同奶牛子宮內(nèi)容物樣品，經(jīng)實驗室初步分離、純化后，涂片，鏡檢，根據(jù)菌落的培養(yǎng)時的形態(tài)特征，顯微鏡下細菌的形態(tài)特征，初步確定的細菌是革蘭陽性或陰性細菌，然后進行生化鑒定，6 種病原菌生化鑒定結(jié)果見表2。

表2 生化鑒定結(jié)果

2.3 中藥的抑菌效果 采用打孔法進行單味中藥的藥物敏感性試驗，對于不同的細菌，根據(jù)其不同的培養(yǎng)特性，采用不同的培養(yǎng)基，在其培養(yǎng)基上打孔后，注入藥液后，按照其特性，嚴格進行培養(yǎng)，對6 種細菌進行13 種單味中草藥的體外抑菌試驗，結(jié)果見表3。多數(shù)單味中藥對6 種細菌均有程度不同的抑制作用。其中以黃芩、硼砂、連翹、蒲公英、淫羊藿、大黃、丹參的抑菌效果較好。以單味藥對各種細菌抑菌圈直徑的平均值比較，排在前6 位的是淫羊藿（9.97）、硼砂（9.62）、黃芩（9.55）、蒲公英（9.5）、丹參（9.07）、連翹（8.98）。

3 討論

普遍認為子宮內(nèi)膜炎的直接病因是產(chǎn)后各種病原微生物的感染所引起的，奶牛子宮內(nèi)膜炎病原微生物比較復雜，不同地區(qū)不同情況下分離到的細菌種類和比例也有差異[4]。本試驗對疑似子宮內(nèi)膜炎奶牛病原細菌進行分離，張家口地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌為大腸桿菌，葡萄球菌，鏈球菌，分泌屬化膿菌，蠟樣芽孢桿菌，沙門菌等。分離到的細菌大多為廣泛存在于環(huán)境中及畜體內(nèi)的常見菌，其中有些是條件性致病菌，可見子宮內(nèi)膜炎是因奶牛產(chǎn)后體質(zhì)虛弱、免疫力下降，環(huán)境中及畜體內(nèi)病原微生物乘機侵入所致，這與我們進行的病因?qū)W調(diào)查中發(fā)現(xiàn)奶牛場中存在的接產(chǎn)或人工授精時消毒不嚴及牛場衛(wèi)生條件較差的狀況相吻合。在所檢驗的30 頭患病奶牛中，單一感染和混合感染同時存在，主要為多種細菌的混合感染，這與地區(qū)性飼養(yǎng)管理水平、環(huán)境因素有極大的關系，同時也與沒有及時進行早期診斷治療有關。一旦一種病原微生物感染后，由于未能及時采取措施和早期治療，造成子宮內(nèi)膜和機體的抵抗力下降，極易誘發(fā)各種條件性病原微生物的繼發(fā)感染。由于混合感染的比例極高，導致治療上的難度增加，從而使治愈率下降。這也是當前張家口奶牛子宮內(nèi)膜炎臨床治愈率低下的主要原因之一。本試驗中首先通過單味中藥的抑菌試驗，篩選出抑菌效果較好的中藥7 種：黃芩、硼砂、連翹、蒲公英、淫羊藿、大黃、丹參。

表3 單味中藥對6種分離細菌的抑菌圈直徑（mm）

[1]陳星，胡松華，張克春，等.奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46（1）：43-44.

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[6]謝仲權，牛樹琦，劉鳳華.天然物中草藥飼料添加劑研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2001：96.

[7]吳明樓，劉士喜，蘇輝，等.奶牛子宮內(nèi)膜炎分泌物病原菌和病理學探討[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2003，31（1）：106-107.