基于PCR的幾種分子檢測技術(shù)在布魯氏菌鑒定中的應(yīng)用

趙 波綜述，崔步云審校

（1．重慶市疾病預(yù)防控制中心微生物所 400042；2．中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所，北京102206）

布魯氏菌病是由布魯氏菌屬的細菌侵入機體引起的人獸共患傳染病，常造成牲畜流產(chǎn)和人類多器官的損害。布魯氏菌屬基于宿主特異性分為6個種19個型：馬耳他布魯氏菌（羊型布魯氏菌）3個型、流產(chǎn)布魯氏菌（牛型布魯氏菌）8個型、豬布魯氏菌5個型和犬種布魯氏菌、林鼠布魯氏菌、綿羊布魯氏菌各1個型［1］，其中，引起人類疾病的主要有羊、牛、豬和狗布魯菌。布魯氏病遍布全球，是一個在世界范圍內(nèi)發(fā)生的流行性疾病，嚴重危害流行地區(qū)的人們健康和帶來巨大的經(jīng)濟損失。全世界160多個國家和地區(qū)每年向WHO報告發(fā)病例數(shù)50萬例［2］。中國從2000年起布魯氏菌病疫情出現(xiàn)上升趨勢，并且由原來主要局限在幾個重要的牧區(qū)，近幾年全國幾乎所有?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）都有病例報道，人間發(fā)病率達到1．55／10萬［3］。由于布魯氏菌的病原學(xué)和致病特點，大量的活菌操作都被要求在生物安全三級實驗室中進行［4］，而關(guān)于布魯氏菌的常規(guī)的細菌學(xué)鑒定，比如生化、生物學(xué)等鑒定都涉及大量活菌的操作，但國內(nèi)的實際是三級實驗室只有極少數(shù)實驗室裝備。因此，近年發(fā)展起來的基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測與鑒定布魯氏菌的一些方法引起了大家的重視，與常規(guī)的檢測方法比較，它需要的菌量少，并且不要求活菌，極大地降低了實驗室感染概率，在生物安全二級實驗室就可以進行。本文就目前基于PCR檢測和鑒定布魯氏菌的方法的研究和應(yīng)用綜述如下。

1 普通PCR檢測技術(shù)

普通PCR根據(jù)布魯氏菌的一段特異性核酸序列來設(shè)計引物，PCR檢測布魯氏菌最早是由Baily報道的，目前使用得比較多的目標基因有16SrRNA、BCSP31、omp2［4－8］等。選擇不同的目標基因?qū)z測的結(jié)果敏感性和特異性都有影響［9］，有研究以16SrRNA、BCSP31、omp2作為目標基因進行比較，研究它們在血中做PCR檢測布魯氏菌的靈敏度和特異度差異，得出16SrRNA檢測相對靈敏度是最低的，而BCSP31檢測是最敏感的［10］。

2 多重PCR檢測技術(shù)

多重PCR在微生物檢測中的應(yīng)用一般是設(shè)計多種病原微生物的特異性引物，在同一PCR反應(yīng)管進行PCR擴增，可用于同時檢測多種病原體或鑒定出是哪一型病原體感染。Probert等［11］對用多重PCR檢測布魯氏菌進行了研究，但只能區(qū)分少數(shù)的幾種布魯氏菌。García－Yoldi等［12］根據(jù)布魯氏菌不同種的特異性DNA片段設(shè)計引物，一共設(shè)計了8對引物，多重PCR擴增后按照電泳片段多寡和片段大小不同可以對6種布魯氏菌都進行區(qū)分。劉志國等［13］將多重PCR與熒光PCR技術(shù)結(jié)合進行研究，建立的方法有靈敏度高、快速、易操作等優(yōu)點，可用于布魯氏菌快速鑒定，并同時確定是否為牛種或羊種布魯氏菌。

3 AMOS－PCR檢測技術(shù)

布魯氏菌的AMOS－PCR檢測是基于細菌染色體上的重復(fù)插入序列IS711的發(fā)現(xiàn)建立的，IS711對布魯氏菌屬是特異性的，而且在絕大多數(shù)布魯氏菌種的染色體上至少有一個拷貝序列［14］。有研究者［15－16］根據(jù)布魯氏菌 不同種IS711位 置的差異設(shè)計引物，一共設(shè)計了5條引物，建立了AMOS－PCR檢測布魯氏菌的方法：即將一個共用引物錨定在這段IS711序列上，其他4條不同的引物分別選在與IS711序列鄰近的DNA的特異序列中，通過4個PCR反應(yīng)的擴增產(chǎn)物的大小和有無來鑒別布魯氏菌種。這種方法能檢測牛布魯氏菌的生物1、2和4型，羊布魯氏菌的所有3種生物型，豬布魯氏菌的生物1型和綿羊布魯氏菌的所有生物型［15］。后來為了區(qū)分布魯氏菌疫苗株S19和RB51，另外3條引物被增加到上述的AMOSPCR方 法 中［16－17］。AMOS－PCR 能 檢 測 大 部 分 布 魯 氏 菌 到種［15］。

4 細菌基因組重復(fù)序列PCR（Rep－PCR）檢測技術(shù)

研究發(fā)現(xiàn)細菌基因組中存在一些特殊的重復(fù)序列，常見的包括基因外重復(fù)回文系列（repetitive extragenic palindromic，REP）、腸桿菌基因間重復(fù)一致序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）和BOX［18－19］，BOX是 DNA序列中一種特異的功能序列，它們在菌株、種、屬水平上進化過程有相對保守性，但分布有差異。Rep－PCR通過擴增細菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列，然后對電泳條帶進行分析比較，來揭示基因組間的差異，在細菌演化和流行病學(xué)研究中是一種重要的手段［20］。在3種重復(fù)序列中，根據(jù)BOX重復(fù)原件設(shè)計引物的Rep－PCR對細菌的區(qū)分能力是最高的［21］。

5 多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析技術(shù)（MLVA）

基因組的研究發(fā)現(xiàn)細菌基因組中分布著一種可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable－number tandem－repeat，VNTR），VNTR有一定的序列和重復(fù)的特點。MLVA的原理即根據(jù)研究的需要選取多個VNTR位點設(shè)計引物，通過多個PCR擴增這些位點序列，依據(jù)電泳結(jié)果，必要時也可以通過測序得出VNTR大小、位點的不同以達到菌株分型的目的。Flèche等［22］用篩選了15個微衛(wèi)星串聯(lián)重復(fù)序列等位標記對已知的236株布魯氏菌菌株進行了分析，分出來的簇和原本的生物型符合度高。并且他們將15個等位標記分成兩組，一組由8個標記組成，能夠?qū)⒉剪斒暇鷧^(qū)分到種；另外一組由7個標記組成，有更高的分型能力，能夠?qū)ΨN進行分型。由于MLVA可以數(shù)字分析的優(yōu)勢，有研究機構(gòu)建立了在線的布魯氏菌MLVA數(shù)據(jù)庫，巴黎第11大學(xué)于2007年建立了基于MLVA分型方法的在線數(shù)據(jù)庫（http：／／mlva．u－psud．fr／brucella／），訪者可以免費瀏覽和查詢該數(shù)據(jù)庫［23］。在線數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用將極大地方便全球布魯氏菌分析的交流和比較。

以上幾種基于PCR建立的檢測和鑒定布魯氏菌的方法比較，普通PCR只能夠?qū)⒉剪斒暇b定到屬；多重PCR能夠?qū)⒉剪斒暇b定到一些種，但多重PCR對DNA提取的純度和PCR反應(yīng)體系的條件要求較高，否則將出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象［12］；AMOS－PCR能夠檢測幾種重要的布魯氏菌種，已經(jīng)能應(yīng)付絕大多數(shù)的疫情處理［15］；Rep－PCR主要應(yīng)用于布魯氏菌的分型研究，但由于操作人員和實驗室條件的變化對實驗結(jié)果影響比較大，應(yīng)用上受到一定的限制；MLVA技術(shù)比較容易標準化，結(jié)果容易解釋，對種和型都能夠進行分析，而且易于各實驗室的交流比較，顯示了很好的發(fā)展前景［24］。

［1］ Cloeckaert A，Verger JM，Grayon M，et al．Classification of brucella spp．isolated from Marine mammals by DNA polymorphism at the omp2locus［J］．Microbes Infect，2001，3（9）：729－738．

［2］ Pappas G，Papadimitriou P，Akritidis N，et al．The new global map of human brucellosis［J］．Lancet Infectious Diseases，2006，6（2）：91－99．

［3］ 崔步云．中國布魯氏菌病疫情監(jiān)測與控制［J］．疾病監(jiān)測，2007，22（10）：649－651．

［4］ Bricker BJ．PCR as a diagnostic tool for brucellosis［J］．Vet Microbiol，2002，90（1／4）：435－446．

［5］ Bricker BJ，Ewalt DR．HOOF prints：Brucella strain typing by PCR amplification of multilocus tandem－repeat polymorphisms［J］．Methods Mol Biol，2006，345：141－173．

［6］ Mukherjee F，Jain J，Patel V，et al．Multiple genus－specific markers in PCR assays improve the specificity and sensitivity of diagnosis of brucellosis in field animals［J］．J Med Microbiol，2007，56（Pt 10）：1309－1316．

［7］ Mukherjee F，Jain J，GrillóMJ，et al．Evaluation of brucella abortus S19vaccine strains by bacteriological tests，molecular analysis of ery loci and virulence in BALB／c mice［J］．Biologicals，2005，33（3）：153－160．

［8］ O′leary S，Sheahan M，Sweeney T．Brucella abortus detection by PCR assay in blood，milk and lymph tissue of serologically positive cows［J］．Res Vet Sci，2006，81（2）：170－176．

［9］ Amin AS，Hamdy ME，Ibrahim AK．Detection of brucella melitensis in semen using the polymerase chain reaction assay［J］．Vet Microbiol，2001，83（1）：37－44．

［10］Versalovic J，Lupski JR．Molecular detection and genotyping of pathogens：more accurate and rapid answers［J］．Trends Microbiol，2002，10（10Suppl）：S15－21．

［11］Probert WS，Schrader KN，Khuong NY，et al．Real－time multiplex PCR assay for detection of Brucella spp．，B．a(chǎn)bortus，and B．melitensis［J］．J Clin Microbiol，2004，42（3）：1290－1293．

［12］García－Yoldi D，Marín CM，de Miguel MJ，et al．Multiplex PCR assay for the identification and differentiation of all Brucella species and the vaccine strains Brucella abortus S19and RB51and Brucella melitensis Rev1［J］．Clin Chem，2006，52（4）：779－781．

［13］劉志國，羅成旺，張利，等．多重?zé)晒舛縋CR方法鑒定布魯氏菌屬及牛羊種布魯氏菌研究［J］．中國人獸共患病學(xué)報，2012，28（9）：869－874．

［14］Cloeckaert A，Grayon M，Grepinet O．An IS711element downstream of the bp26gene is a specific marker of Brucella spp．isolated from Marine mammals［J］．Clin Diagn Lab Immunol，2000，7（5）：835－839．

［15］Nagalingam M，Shome R，Balamurugan V，et al．Molecular typing of Brucella species isolates from livestock and human［J］．Trop Anim Health Prod，2012，44（1）：5－9．

［16］Ewalt DR，Bricker BJ．Validation of the abbreviated Brucella AMOS PCR as a rapid screening method for differentiation of Brucella abortus field strain isolates and the vaccine strains，19and RB51［J］．J Clin Microbiol，2000，38（8）：3085－3086．

［17］López－Go?i I，García－Yoldi D，Marín CM，et al．Evaluation of a multiplex PCR assay （Bruce－ladder）for molecular typing of all Brucella species，including the vaccine strains［J］．J Clin Microbiol，2008，46（10）：3484－3487．

［18］Hendson M，Purcell AH，Chen D，et al．Genetic diversity of Pierce′s disease strains and other pathotypes of Xylella fastidiosa［J］．Appl Environ Microbiol，2001，67（2）：895－903．

［19］Schloter M，Lebuhn M，Heulin T，et al．Ecology and evolution of bacterial microdiversity［J］．FEMS Microbiol Rev，2000，24（5）：647－660．

［20］Hiett KL，Seal BS．Use of repetitive element palindromic PCR （rep－PCR）for the epidemiologic discrimination of foodborne pathogens［J］．Methods Mol Biol，2009，551：49－58．

［21］Jones SW，Dobson ME，F(xiàn)rancesconi SC，et al．DNA assays for detection，identification，and individualization of select agent microorganisms［J］．Croat Med J，2005，46（4）：522－529．

［22］Flèche PL，Jacques I，Grayon M，et al．Evaluation and selection of tandem repeat loci for a Brucella MLVA typing assay［J］．BMC Microbiol，2006，6（1）：9．

［23］Grissa I，Bouchon P，Pourcel C，et al．On－line resources for bacterial micro－evolution studies using MLVA or CRISPR typing［J］．Biochimie，2008，90（4）：660－668．

［24］Van Belkum A．Tracing isolates of bacterial species by multilocus variable number of tandem repeat analysis（MLVA）［J］．FEMS Immunol Med Microbiol，2007，49（1）：22－27．