染料木素磺酸鈉對慢性肝損傷小鼠肝功能及肝組織α7nAchR和IL-1β蛋白表達(dá)的影響*

李小花，黎 曉，萬群雄，李 和，李良東，黃志華，曾 靖

(贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西贛州 341000)

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染料木素磺酸鈉對慢性肝損傷小鼠肝功能及肝組織α7nAchR和IL-1β蛋白表達(dá)的影響*

李小花，黎 曉，萬群雄，李 和，李良東，黃志華△，曾 靖

(贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西贛州 341000)

目的 觀察染料木素磺酸鈉(GSS)對小鼠慢性肝損傷的保護(hù)作用，以及其對肝組織α7尼古丁受體(α7nAChR)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)蛋白表達(dá)的影響。方法 取SPF級雄性昆明種小鼠60只分成5組，分別為對照組、模型組、GSS低劑量組、GSS高劑量組及陽性藥物組，每組12只。除對照組外其余4組采用腹腔注射10%四氯化碳(CCl4)，體積為0.1mL/10g，持續(xù)6周，制備小鼠慢性肝損傷動物模型。同時GSS高、低劑量組分別灌胃給予不同劑量的GSS(0.30、0.10mg/kg)，陽性藥物組給予聯(lián)苯雙酯2.50mg/kg，對照組及模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)6周。測定小鼠血清AST及ALT活性，并計算AST/ALT比值；Westernblot方法檢測α7nAChR、IL-1β蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 模型組小鼠血清ALT、AST水平較對照組升高(P<0.05)，肝組織α7nAChR蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)，IL-1β的表達(dá)水平升高(P<0.05)；經(jīng)GSS治療后，血清AST、ALT水平明顯低于模型組(P<0.05)，α7nAChR表達(dá)水平升高(P<0.01)，IL-1β表達(dá)水平降低(P<0.05)。結(jié)論GSS可升高損傷的肝組織α7nAChR的表達(dá)，激活膽堿能抗炎通路，從而減少致炎細(xì)胞因子的表達(dá)，可通過抑制炎癥反應(yīng)對抗小鼠慢性肝損傷。

染料木素磺酸鈉；慢性肝損傷；α7尼古丁受體；白細(xì)胞介素1β

肝臟疾病是消化系統(tǒng)疾病死亡的重要原因，近年來各地發(fā)病率及病死率明顯上升，目前臨床上缺乏特效治療藥物，研究該類藥物具有重要意義。染料木素為植物雌激素的一種，化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌二醇相似，能與雌激素細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合發(fā)揮作用，如抗腫瘤作用、神經(jīng)保護(hù)作用、調(diào)節(jié)骨代謝與脂代謝、心腦血管保護(hù)及抗氧化等作用[1-7]。但考慮染料木素難溶于水，生物利用度低，勢必影響其臨床應(yīng)用和藥物開發(fā)，因此，課題組參照索志榮等[8]的方法，對染料木素進(jìn)行磺化，合成了染料木素磺酸鈉(genistein sodium sulfonate,GSS)，分子式：C15H10O8SNa，為白色結(jié)晶粉末。課題組前期研究證實GSS對腦缺血再灌注損傷起保護(hù)作用[9]。本實驗通過建立小鼠慢性肝損傷模型，進(jìn)一步研究GSS對肝損害的保護(hù)作用及其對膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級昆明小鼠60只，體質(zhì)量20～25 g，雄性，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2011-003，合格證號：4304701590。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由進(jìn)食和飲水。溫度18～20 ℃，自由光照，相對濕度50%～60%，持續(xù)通風(fēng)換氣。

1.1.2 藥物與試劑 GSS購自天習(xí)化工有限公司，用生理鹽水配成所需濃度；聯(lián)苯雙酯滴丸購自北京協(xié)和藥廠(批號：12060105)；四氯化碳(CCl4)分析純，江西洪都試劑化工廠生產(chǎn)(批號：011224)，臨用前與精制植物油混合配成10%(W/W)的CCl4植物油溶液；AST (貨號：CH0101202)及ALT檢測試劑盒購自四川邁克生物科技有限公司(批號：CH0101201)；β-actin一抗(Ta-09)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(ZB-2303)及山羊抗鼠IgG(ZB-2305)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；α7尼古丁受體(α7nAChR)(sc-5544)及白細(xì)胞介素1β(interleukin-1beta，IL-1β) (sc-7884)一抗購自Santa Cruz公司；BSA蛋白濃度測定試劑盒購自北京天根生化科技有限公司(J8830/M2114)；化學(xué)發(fā)光試劑盒(1856135/1856136)購自Thermo Fisher公司。

1.1.3 儀器 7600-020型全自動生化分析儀購自日本日立公司；Universal Hood Ⅱ型多功能酶標(biāo)儀、3001型超高靈敏度化學(xué)成像發(fā)光儀、Trans-blot轉(zhuǎn)印槽及小型垂直電泳槽購自美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 將60只小鼠分成5組，分別為對照組、模型組、GSS低劑量組、GSS高劑量組及陽性藥物組，每組12只。參考文獻(xiàn)[10]的方法制作小鼠慢性肝損傷模型，除對照組外均腹腔注射10% CCl4油溶液0.10 mL/10 g，每周2次，持續(xù)6周。同時GSS高、低劑量組分別灌胃給予不同劑量的GSS(0.30、0.10 mg/kg)，陽性藥物組給予聯(lián)苯雙酯2.50 mg/kg，對照組及模型組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)6周。

1.2.2 肝功能生化檢測 小鼠末次給藥后，禁食12 h，摘眼球取血，分離血清，按試劑盒說明，用全自動生化分析儀檢測血清ALT和AST水平。

1.3 Western blot方法檢測α7尼古丁受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR)和 IL-1β蛋白表達(dá)水平 為探討GSS對慢性肝損傷的保護(hù)機(jī)制，選擇對照組、模型組、GSS高劑量組肝組織進(jìn)行檢測。取20 mg肝臟組織于1.5 mL離心管中，加入200 μL裂解液，搗碎后，再加入400 μL裂解液，置于4 ℃顛倒混勻1 h。1 100 r/min，4 ℃，離心5 min。取上清液BCA法行蛋白定量。取50 μg總蛋白，加入上樣緩沖液，95 ℃，5 min蛋白變性后，于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白。將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到醋酸纖維素膜上，3%～5%的牛奶室溫封閉1 h。α7nAChR或 IL-1β一抗孵育，4 ℃過夜。二抗室溫孵育1 h。將化學(xué)發(fā)光試劑盒中的兩種試劑按1∶1比例混合，混勻后，在暗室中與硝酸纖維素膜搖動孵育1 min，于超高靈敏度化學(xué)成像發(fā)光儀照相，并計算灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清ALT和AST水平比較 與對照組比較，模型組小鼠血清ALT及AST水平均明顯升高(P<0.05)，提示肝損傷模型制作成功；經(jīng)GSS治療后，血清ALT及AST水平均降低(P<0.05)，與陽性藥物組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；陽性藥物組AST/ALT較模型組升高，GSS高、低劑量組AST/ALT與陽性藥物組比較，明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.2 對照組、模型組及GSS高劑量組小鼠肝組織α7nAChR和IL-1β蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組肝組織α7nAChR蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)，IL-1β表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組比較，GSS高劑量組肝組織α7nAChR蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01)，IL-1β表達(dá)水平降低(P<0.05)，見圖1、2。

表1 各組小鼠血清ALT和AST水平比較

a：P<0.05,b：P<0.01與對照組比較；c：P<0.05,d：P<0.01,與模型組比較；e：P<0.05，f：P<0.01與陽性藥物組比較。

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，與模型組比較。

圖1 各組小鼠肝組織α7nAChR蛋白表達(dá)水平比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

圖2 各組小鼠肝組織IL-1β蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

肝臟是人體最大的實質(zhì)性器官，擔(dān)負(fù)消化、解毒、分泌和生物合成功能，其功能障礙直接影響人體健康，甚至危及生命。肝病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及炎性反應(yīng)、免疫功能紊亂、代謝障礙、自由基損害及質(zhì)膜損傷等多個生理病理過程。CCl4致肝損傷動物模型是研究護(hù)肝藥最常用的模型。CCl4在肝微粒體細(xì)胞色素P450代謝生成氧自由基，這些自由基攻擊肝細(xì)胞膜上的磷脂分子，使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，繼而與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)大分子發(fā)生共價結(jié)合。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酶類滲入到血液中，同時細(xì)胞外水分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變等，嚴(yán)重時可導(dǎo)致細(xì)胞壞死，更多的酶類釋放進(jìn)入血液。因此，血清轉(zhuǎn)氨酶升高，在一定程度上反映了肝細(xì)胞損害和壞死的程度。在輕、中度肝損傷時，以ALT升高為明顯，ALT升高遠(yuǎn)大于AST升高；當(dāng)嚴(yán)重肝細(xì)胞損傷時，線粒體受損，可導(dǎo)致線粒體內(nèi)的酶被釋放入血，此時AST升高更為明顯，血清中AST/ALT比值升高。在實驗中，CCl4肝損傷模型小鼠血清AST及ALT水平均顯著升高，但AST/ALT比值變化不明顯，提示肝損傷更為嚴(yán)重。經(jīng)GSS治療后，血清AST和ALT水平均降低，說明GSS對CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷有保護(hù)作用。

2000年，Borovikova等[11]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)通過迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)乙酰膽堿能夠顯著、快速地抑制炎性反應(yīng)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，減輕全身性炎性反應(yīng)。這一生理機(jī)制稱作CAP。膽堿能信號調(diào)節(jié)異常參與多種炎性反應(yīng)紊亂(如AD、腦出血和敗血癥等)[12]。刺激外周迷走神經(jīng)及應(yīng)用膽堿能遞質(zhì)乙酰膽堿(Acetylcholine,Ach)或擬膽堿藥物煙堿能抑制實驗性炎性反應(yīng)，顯著降低細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等的釋放[13]。α7nAChR是CAP中的關(guān)鍵受體，它的興奮介導(dǎo)了大部分的ACh在免疫系統(tǒng)中的效應(yīng)[14]。IL-1β具有廣泛的生物作用，可通過自分泌或旁分泌影響其他細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌，誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞表面免疫分子的表達(dá)；其作為T細(xì)胞和B細(xì)胞的激活和分化因子，可介導(dǎo)免疫球蛋白的分泌、激活補(bǔ)體、殺傷細(xì)胞和吞噬細(xì)胞，增強(qiáng)由細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)介導(dǎo)的組織損傷[15]。在藥物誘導(dǎo)大鼠肝損傷模型中IL-1β高表達(dá)，應(yīng)用護(hù)肝藥物后可抑制IL-1β表達(dá)[16]，從而達(dá)到護(hù)肝作用。本實驗結(jié)果顯示，GSS高劑量組α7nAchR受體表達(dá)較模型組明顯升高，而IL-1β水平明顯降低，提示GSS可激活CAP，從而減少致炎細(xì)胞因子如IL-1β的表達(dá)，通過抑制炎性反應(yīng)對抗CCl4誘導(dǎo)的小鼠慢性肝損傷。

[1]LinAH,LeungGP,LeungSW,etal.Genisteinenhancesrelaxationofthespontaneouslyhypertensiverataortabytransactivationofepidermalgrowthfactorreceptorfollowingbindingtomembraneestrogenreceptors-αandactivationofaGprotein-coupled,endothelialnitricoxidesynthase-dependentpathway[J].PharmacolRes,2011,63(3):181-189.

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Effects of genistein sodium sulfonate on liver function and liver tissue α7nAchR and IL-1β expression in mice chronic hepatic injury*

LiXiaohua,LiXiao,WanQunxiong,LiHe,LiLiangdong,HuangZhihua△,ZengJing

(CollegeofBasicMedicine,GannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000,China)

Objective To observe the protective effects of genistein sodium sulfonate(GSS) on mice chronic hepatic injury induced by carbon tetrachloride(CCl4) and its influence on the protein expression of α7 nicotinic acetylcholine receptor(α7nAChR) and interleukin-1 beta (IL-1β) in liver tissue.Methods 60 SPF grade male Kunming mice were randomly divided into 5 groups,including the control group,model group,low and high doses GSS groups,and positive control group,12 cases in each group.Except for the control group,the other 4 groups were intra peritoneally injected by 10 % CCl4with a volume of 0.1 mL/10 g for 6 weeks.The mice chronic liver injury was prepared.At the same time,the high and low doses DSS groups were given the different doses of GSS(0.30,0.10 mg/kg),the positive control group was given bifendate(DDB,2.5mg/kg),the control group and the model group were given the equal volume of normal saline for 6 consecutive weeks.The AST and ALT activity was detect and the ratio of ALT/ AST was calculated;the Western blot method was used to detect the expression levels of α7nAChR and IL-1β protein in liver.Results The serum levels of ALT and AST in the model group were increased obviously,and the expression level of α7nAChR in the liver tissue was decreased,while the expression level of IL-1β was increased;after the GSS treatment,the serum AST and ALT levels were significantly lower than those in the model group(P<0.05),while the expression level of α7nAChR was increased (P<0.01) and the expression level of IL-1β was decreased(P<0.05).Conclusion GSS might increase the expression of α7nAChR in injured liver tissue,activates the cholinergic anti-inflammatory pathway,thus decreases the expression of inflammatory cytokines and antagonizes the mice chronic liver injury by inhibiting the inflammatory reaction.

genistein sodium sulfonate;chronic hepatic injury;α7 nicotinic acetylcholine receptor;interleukin-1beta

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10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.004

國家自然科學(xué)基金資助項目(31360250)；江西省自然科學(xué)基金資助項目(20122BAB205037)。 作者簡介：李小花(1976-)，實驗師，碩士研究生，主要從事中藥藥理研究?！?/p>

，Tel:18970786003；E-mail：gnyxyhzh@163.com。

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A

1671-8348(2015)10-1308-03

2014-11-15

2014-12-20)