基于連接酶-瓊脂糖凝膠電泳的單核苷酸多態(tài)性快速檢測方法＊

崔海忠，肖 娜，張永平，陳大貴，唐一通△，趙雪紅，邵金輝

（湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院：1.棗陽臨床學(xué)院腫瘤科，湖北棗陽441200；2.分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北襄陽441053）

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指DNA 序列上發(fā)生的單個(gè)核苷酸堿基的變異，在人群中的分布率占1%以上。SNP是人類基因組中最常見的變異形式，現(xiàn)有公共數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)報(bào)道了超過900萬個(gè)SNP位點(diǎn)。SNP被認(rèn)為是疾病易感性和藥物反應(yīng)的決定因素，開展SNP 研究對醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、臨床診斷、藥物開發(fā)與合理用藥等的發(fā)展都具有非常重要的意義［1］。SNP 的基因分型檢測工作，已成為當(dāng)前國際上研究的熱點(diǎn)。近年來，隨著生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的快速發(fā)展，SNP檢測方法和相關(guān)儀器的研發(fā)進(jìn)展很快。目前，有20余種SNP突變檢測方法，如限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）［2］，PCR-SSCP［3］，DNA 測序，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）［4］，TaqMan PCR［5］，焦 磷 酸 測 序（Pyrosequencing）［6］，質(zhì)譜（Mass Spectrometry）［7］，連接酶鏈反應(yīng)（Ligase Detection Reaction）［8］，基 因 芯 片［9］，SNPstream 技術(shù)［10］，分子燈塔技術(shù)［11］等。其中DNA 直接測序是傳統(tǒng)的序列測定的方法，但是其檢測靈敏度低，在對腫瘤組織、穿刺活檢組織或體液等不均一樣本進(jìn)行SNP突變檢測時(shí)具有較大局限性。雖然Pyrosequencing、熒光定量PCR、質(zhì)譜等方法具有較高的靈敏度，但這些方法對實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備具有很高的要求，在簡單實(shí)驗(yàn)條件下的常規(guī)臨床檢測中很少能夠應(yīng)用。本研究建立了一種基于連接酶-凝膠電泳的簡便、快速、靈敏的SNP突變檢測方法，適合于在簡單實(shí)驗(yàn)條件下對不均一樣本進(jìn)行常規(guī)突變檢測。并對在非小細(xì)胞肺癌酪氨酸激酶抑制劑藥物個(gè)體化治療中的生物標(biāo)記基因表皮生長因子受體（EGFR）為檢測對象，對有較高突變頻率的EGFR，c.2573T＞G（L858R），EGFR，c.2582T＞A（L861Q）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了分型檢測。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從棗陽臨床學(xué)院腫瘤科62 例非小細(xì)胞肺癌血漿樣本中抽提循環(huán)DNA，-20 ℃保存。（1）檢測樣本：攜帶有野生型和突變型等位基因的EGFR，c.2582T＞A（L861Q），EGFR，c.2573T＞G（L858R）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）3個(gè)SNP突變位點(diǎn)的質(zhì)粒DNA 以黃杰等［12］定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建。寡核苷酸探針：針對每個(gè)SNP位點(diǎn)，用3條寡核苷酸探針進(jìn)行檢測。分別為上游的兩條特異性檢測探針和下游的一條公用探針（圖1）。在兩條特異性探針的5′端，為一段通用擴(kuò)增引物序列Tag1，3′端為與模板上突變位點(diǎn)一側(cè)的序列互補(bǔ)的序列，并且3′末端堿基與突變位點(diǎn)堿基對應(yīng)互補(bǔ)，野生型檢測探針（WT-Probe）與野生型等位基因互補(bǔ)，突變型檢測探針（MT-Probe）與突變型等位基因互補(bǔ)，在特異性探針的5′端分別進(jìn)行生物素修飾。公用檢測探針5′端為與SNP位點(diǎn)另一側(cè)序列互補(bǔ)的序列，3′端為一段通用擴(kuò)增引物序列Tag2。對EGFR，c.2582T＞A（L861Q），EGFR，c.2573T＞G（L858R）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測的探針序列，見表1。對檢測探針進(jìn)行通用擴(kuò)增的Tag1序列和Tag2的互補(bǔ)序列（CTag2）分別為：Tag1：5′-TTT TTT TGG GTT CGT GGT AGA GCG TCG GAG T-3′；CTag2：5′-CCA GAC GAC ACC GAG ATA GCA GCC-3′。（2）實(shí)驗(yàn)試劑：Low MW DNA Marker-A 購自生工生物工程（上海）有限公司，2×PCR Mastermix購自天根生化科技北京有限公司，鏈親和素（Streptavidin）磁珠購自西安金磁納米生物技術(shù)有限公司，Taq DNA ligase購自New England BioLabs。TA 克隆試劑盒、TaKaRa Ex Taq酶購自寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN）購自上海葉舟生物科技有限公司。核酸序列均由上海生工生物有限公司合成。其余試劑均為分析純。

圖1 檢測探針設(shè)計(jì)示意圖

表1 寡核苷酸檢測探針序列

1.2 方法

1.2.1 EGFR基因擴(kuò)增對基因外顯子18和21進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為：exon 21-forward：5′-GAG CTT CTT CCC ATG ATG ATC T-3′；exon 21-reverse：5′-GAA AAT GCT GGC TGA CCT AAA G-3′；exon 18-forward：5′-GAG GTG ACC CTT GTC TCT GTG T-3′；exon 18-reverse：5′-CCC AAA CAC TCA GTG AAA CAA A-3′。擴(kuò)增體系為：3μL 循環(huán)DNA 樣本，0.5μmol／L擴(kuò)增引物，15μL 2×Taq PCR Mastermix，去離子水補(bǔ)足30μL。擴(kuò)增條件為：95°C 預(yù)變性4 min，95°C 變性30s，60°C 退火30s，72°C 延伸40s，35 個(gè)循環(huán)；72°C再延伸4min。各樣本擴(kuò)增產(chǎn)物用直接測序法測定突變類型。

1.2.2 連接反應(yīng) 針對每個(gè)SNP位點(diǎn)，用兩個(gè)檢測管進(jìn)行檢測，并分別標(biāo)記為WT 管和MT 管。兩管分別加入3μL 10×連接反應(yīng)緩沖液，5μL 模板序列和1 U 的Taq ligase，在MT管中加入50fmol突變型特異性檢測探針和公用檢測探針，WT 管中加入50fmol野生型特異性檢測探針和公用檢測探針，去離子水補(bǔ)足30μL。對于每個(gè)檢測位點(diǎn)，設(shè)定一對照管CT，對照管中不加入模板序列，其它成分與檢測管相同。反應(yīng)條件為：94 ℃變性40s，60 ℃退火5min；5個(gè)循環(huán)；95℃變性5min。

1.2.3 純化反應(yīng) 按照Streptavidin 磁珠操作說明，對各SNP位點(diǎn)對應(yīng)各管擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。加入20μL Tris-HCl（10mmoL，pH7.5）重新懸浮磁粒。

1.2.4 通用擴(kuò)增反應(yīng) 取15μL 2×PCR Mastermix，5μL各管對應(yīng)純化磁性微粒，2μmol／L 的通用擴(kuò)增引物Tag1 和CTag2，去離子水補(bǔ)足30μL。95℃預(yù)變性30s；95℃變性25 s，60℃退火45s，72℃延伸20s；20個(gè)循環(huán)，72℃延伸1min進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 分別取各SNP突變位點(diǎn)對應(yīng)MT 管、WT 管和CT 管擴(kuò)增產(chǎn)物5L 進(jìn)行3.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)3個(gè)反應(yīng)管對應(yīng)泳道在目標(biāo)位置電泳條帶出現(xiàn)的情況判定檢測突變位點(diǎn)基因型。如果WT 管和MT 管對應(yīng)泳道均出現(xiàn)條帶，則該SNP位點(diǎn)為野生／突變型；如果只有WT 管對應(yīng)泳道出現(xiàn)條帶，則該SNP位點(diǎn)為純合野生型；如果只有MT 管對應(yīng)泳道出現(xiàn)條帶，則檢測SNP為純合突變型。

2 結(jié) 果

2.1 檢測方法流程 通過連接反應(yīng)，WT 管中野生型檢測探針和公用探針能夠完成連接，而MT 管中突變型檢測探針和公用探針不能連接。經(jīng)鏈親和素磁性微粒的純化反應(yīng)，WT 管中完成連接反應(yīng)的探針被純化固定在鏈親和素磁性微粒上。以Tag1和CTag2作為通用引物，對WT 管和MT 管中磁性微粒純化產(chǎn)物進(jìn)行通用擴(kuò)增反應(yīng)，最后在瓊脂糖凝膠電泳水平對突變位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測。通過觀察WT 管和MT 管對應(yīng)電泳泳道條帶的出現(xiàn)情況進(jìn)行結(jié)果判定。WT 管對應(yīng)泳道出現(xiàn)條帶，而MT 管對應(yīng)泳道無條帶，說明檢測SNP位點(diǎn)為野生純合子基因型。野生純合子SNP位點(diǎn)的檢測示意圖，見圖2。

圖2 分型方法檢測流程圖

2.2 連接溫度的優(yōu)化 進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)，退火溫度是影響反應(yīng)靈敏度及特異性的一個(gè)重要因素，特異性會隨著退火溫度的升高而有所提高，但是較高的退火溫度也會使得退火效率降低從而影響檢測的靈敏度。以L858R 野生型質(zhì)粒模板為檢測對象，分別在55、60、65 ℃的退火溫度條件下，經(jīng)檢測探針的連接，純化和PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，在55、60 ℃兩個(gè)溫度梯度條件下，均明顯在WT 管對應(yīng)泳道出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，而其余泳道均無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)；但是當(dāng)退火溫度上升為65 ℃時(shí)，3個(gè)泳道均無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。說明檢測探針在檢測模板上的退火能力隨著反應(yīng)溫度的升高而降低，在55～60℃時(shí)能夠有效的保證檢測探針在檢測模板上的退火從而完成連接反應(yīng)。但是在65 ℃條件下，檢測探針無法有效的退火到模板上，使得連接反應(yīng)不易完成，從而無目的擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)。因?yàn)樵趯z測探針設(shè)計(jì)時(shí)，將所有檢測探針上H1、H2序列的Tm 值均設(shè)計(jì)為58～60℃，所以為了即能夠保證探針在模板上的有效退火，又能夠保證連接反應(yīng)的特異性，選定60 ℃作為連接反應(yīng)的溫度。

圖3 連接溫度的優(yōu)化

2.3 特異性檢測 通過擴(kuò)增反應(yīng)中的循環(huán)次數(shù)對本方法的特異性進(jìn)行檢測，分別對L858R 野生／突變混合模板和L861Q 、G719C兩個(gè)野生型等位基因模板進(jìn)行檢測。分別作20和30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，將各管5μL 擴(kuò)增產(chǎn)物做3.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4所示。兩種循環(huán)條件下，在L858R 位點(diǎn)的MT管和WT 管對應(yīng)泳道中均出現(xiàn)明顯擴(kuò)增條帶，而G719C 和L861Q 兩個(gè)位點(diǎn)對應(yīng)的WT 管泳道出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，MT 泳道均未有條帶出現(xiàn)。同時(shí)，3個(gè)位點(diǎn)對應(yīng)CT 管泳道均未出現(xiàn)條帶。說明此方法具有較高的檢測特異性和擴(kuò)增容量。

圖4 分型方法特異性檢測

2.4 敏感性檢測 以L858R 位點(diǎn)為檢測對象，分別設(shè)定突變等位基因在總檢測模板中的比例為50.00%、25.00%、5.00%、2.50%，對不同比例的混合等位基因進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖5所示，各條件下，在MT 和WT 管對應(yīng)的泳道中均有擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，且隨著突變型等位基因所占比例的減少，MT 管對應(yīng)泳道中擴(kuò)增條帶亮度逐漸減弱，但當(dāng)突變等位基因在混合等位基因中比例低至2.50%時(shí)，仍能夠在MT 管對應(yīng)泳道中檢測出擴(kuò)增條帶，說明本方法有著較高的檢測靈敏度，適合于從不均一的樣本中對突變等位基因進(jìn)行檢測。

圖5 L858R 位點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳水平敏感度檢測

2.5 樣本檢測 利用本方法對62 例樣本中EGFR，c.2573 T＞G（L858R），EGFR，c.2582T＞A（L861Q）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了檢測，并與直接測序結(jié)果進(jìn)行了比較。兩種方法未檢測到L861Q 和G719C 位點(diǎn)的突變，但均檢測到L858R 位點(diǎn)有雜合子突變。如圖6所示，通過直接測序方法僅可以明確檢測出8＃和15＃兩例樣本是L858R 位點(diǎn)雜合子突變，23＃樣本出現(xiàn)類似雜峰的突變堿基對應(yīng)峰，故無法給出明確的基因型判斷。而通過連接酶-瓊脂糖凝膠電泳方法共檢測出8＃，15＃，23＃，6＃，11＃，14＃共6例樣本是L858R 雜合子突變（圖7）。結(jié)果證明，連接酶-瓊脂糖凝膠電泳方法比直接測序方法具有更高的靈敏度，適合于對不均一樣本或雜合子突變位點(diǎn)的檢測。

圖6 循環(huán)DNA 樣本EGFR，c.2573T＞G（L858R）位點(diǎn)突變測序圖

圖7 樣本EGFR，c.2573T＞G（L858R）位點(diǎn)突變檢測圖

3 討 論

隨著人類生物信息學(xué)資源的爆炸性積累，極大地推動了SNP突變檢測技術(shù)的發(fā)展。但是，SNP 突變檢測技術(shù)在檢測成本、靈敏性和常規(guī)性等方面仍需要進(jìn)行改進(jìn)。如傳統(tǒng)的DNA 直接測序方法的靈敏度只有20%［13-14］，檢測位點(diǎn)突變等位基因?qū)?yīng)測定峰線很低，無法明確從背景峰中分離（圖6），因此，不能夠從不均一樣本中對突變等位基因進(jìn)行檢測。雖然實(shí)時(shí)定量PCR、焦磷酸測序，以及質(zhì)譜等檢測方法的靈敏度較高，文獻(xiàn)報(bào)道稱可達(dá)到1%［14-15］，但是這些檢測方法都要求具備昂貴的檢測設(shè)備和實(shí)驗(yàn)試劑，因而不能夠在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行突變檢測，限制了其在基層醫(yī)療或研究機(jī)構(gòu)的應(yīng)用。

本研究建立的SNP突變檢測方法基于連接酶反應(yīng)原理，通過檢測探針的連接反應(yīng)，鏈親和素磁性微粒對連接探針的純化反應(yīng)以及通用擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)，利用瓊脂糖凝膠電泳方法進(jìn)行SNP突變位點(diǎn)的分型檢測。本方法具有較高的檢測靈敏度，能夠從野生／突變位點(diǎn)所在混合質(zhì)粒模板中檢測出低至2.50%的突變型等位基因，因此，適合于從不均一樣本中對突變等位基因進(jìn)行檢測。而且，與其他檢測方法如熒光定量PCR，質(zhì)譜，DNA 直接測序等方法相比，本方法操作簡單，不需要借助昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備，只需普通PCR 儀、凝膠電泳等簡單實(shí)驗(yàn)條件即能完成，同時(shí)，所需探針長度均小于50bp，合成成本低，沒有對熒光探針等昂貴試劑及高質(zhì)量檢測樣本的要求，具有較低的實(shí)驗(yàn)成本和易操作性，因此，更適合于在常規(guī)、簡單實(shí)驗(yàn)條件下的突變檢測。

本方法較高的檢測特異性通過以下條件保證：（1）在設(shè)計(jì)檢測探針時(shí)，除了依靠特異性檢測探針3′端堿基與突變堿基的配對識別能力外，還在其3′端上游第3個(gè)堿基處引入1個(gè)錯(cuò)配堿基以增強(qiáng)探針的識別能力；（2）特異性檢測探針和公用探針的H1和H2序列的Tm 值與通用擴(kuò)增引物Tag1 和Tag2序列的Tm 值相差7～8度，以減少連接反應(yīng)和后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)之間的影響；（3）高保真性Taq DNA 連接酶對錯(cuò)配堿基的識別作用。本方法同時(shí)具有較高檢測靈敏度，其是通過在探針序列上設(shè)計(jì)通用擴(kuò)增引物序列Tag1和Tag2，完成連接反應(yīng)后，進(jìn)行了連接產(chǎn)物的二次擴(kuò)增以極大增加連接產(chǎn)物的數(shù)量，從而能夠在瓊脂糖凝膠電泳水平進(jìn)行快速檢測。但瓊脂糖凝膠電泳的檢測靈敏度具有局限性，因此，當(dāng)突變等位基因在不均一樣本總的比例低至2.50%時(shí)，就不能夠得以檢測。同時(shí)，在檢測通量上也有限制，不適合于進(jìn)行高通量的突變檢測。

綜上所述，本研究建立了一種基于連接酶-凝膠電泳的SNP分型新方法，并對與酪氨酸激酶抑制劑個(gè)體化用藥密切相關(guān)的EGFR 基因的3個(gè)常見SNP位點(diǎn)EGFR，c.2582T＞A（L861Q），EGFR，c.2573T＞G（L858R）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）進(jìn)行了檢測。該方法操作簡便，有較高的檢測特異性和靈敏度，適合于在一般實(shí)驗(yàn)條件下對不均一樣本進(jìn)行常規(guī)突變檢測。

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