漆酶/天然介體體系漂白硫酸鹽竹漿的機理研究

周生飛 詹懷宇 姚向榮 付時雨

（華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東廣州，510640）

漆酶/天然介體體系是一種對環(huán)境友好的生物反應體系，在制漿造紙中有著重要的應用。在二次纖維回用中，它有助于廢紙脫墨，提高脫墨漿的可漂性，同時提高紙漿的裂斷長和撕裂指數(shù)；在高得率制漿中，它能顯著降低能耗，提高成紙強度；在化學法制漿中，它能降低紙漿卡伯值，提高白度；在紙漿漂白中，它能取代傳統(tǒng)的含氯漂白，降低有毒和致癌物質的排放量，減少對環(huán)境的污染和人類的危害；在造紙廢水處理中，它能降解造紙廢水中的有毒物質和有色物質。此外，它還能用于改善紙漿纖維性能，提高紙張濕強度等［1］。

筆者曾用羥基苯甲酸、香草酸、對羥基苯甲醛、丁香酸、香草醛、丁香醛、乙酰丁香酮等7種小分子酚醛物質及它們的混合物作為漆酶/介體體系的天然介體，用于硫酸鹽法竹漿的漆酶/介體體系漂白，這些體系都能不同程度地促進竹漿最終白度的提高和木素的脫除。然而，漆酶/天然介體體系的漂白機理至今仍不十分明確，很有必要繼續(xù)深入探討。本實驗對硫酸鹽竹漿進行了包含漆酶/天然介體體系漂白段的全無氯漂白，并對各段的殘余木素進行了GPC、TGA、FT-IR、1H-NMR和13C-NMR分析，期望通過漆酶/天然介體體系漂白段前后竹漿殘余木素的表征，探索漆酶/天然介體體系的漂白機理。

1 實驗

1.1 原料和藥品

硫酸鹽竹漿，初始卡伯值16.0、白度30.3％。

主要藥品和試劑：漆酶（通過實驗室培養(yǎng)的白腐菌獲得），混合纖維素酶（由CMC酶和Avicel酶組成，液體，夏盛公司提供），吡啶（分析純），醋酸酐（分析純），THF（色譜純），KBr（光譜純），無水乙醇（分析純），DMSO-d6（含TMS）。

1.2 竹漿的TCF漂白

首先對竹漿進行了TCF漂白，漂序為O-LMS-QP，具體操作條件如下。

氧脫木素（O）：在旋轉式反應釜中進行，漿濃10％，NaOH用量4.0％，MgSO4用量0.5％，氧壓0.5MPa，溫度100℃，時間60min。

漆酶/天然介體體系處理（LMS）：在PARR 4843高壓反應釜中進行，所用天然介體為對羥基苯甲酸、香草酸、對羥基苯甲醛、丁香酸、香草醛、丁香醛、乙酰丁香酮等小分子酚醛物質的混合物，漿濃10％，漆酶用量5IU/g，介體用量2％，用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液調節(jié)pH值為4.0，溫度50℃，氧壓0.5MPa，反應時間120min，攪拌轉速150r/min。

螯合處理（Q）：將漿料及化學品密封于塑料袋內，揉搓均勻后置于恒溫水浴鍋中，漿濃10％，ED-TA用量1.0％，漂終pH值3.0，溫度70℃，反應時間60min。

過氧化氫漂白（P）：將漿料及化學品密封于塑料袋內，揉搓均勻后置于恒溫水浴鍋中，漿濃10％，H2O2用量3.0％，NaOH用量2.0％，MgSO4用量0.05％，EDTA用量0.2％，溫度90℃，反應時間150min。

1.3 漂白各段竹漿殘余木素的提取

首先用溫和的酶水解-酸水解法［2］從竹漿中制備粗木素，然后用乙醚對粗木素進行提純。

溫和的酶水解：將濕潤的竹漿置于三角瓶中，加入一定量的去離子水，漿濃約為3％；加入pH值4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，使?jié){中離子濃度為50mmol/L；加入混合纖維素酶，用量為50FPU/g（絕干漿），然后將三角瓶置于50℃的搖床內，在200r/min下振蕩，24h后再次加入酶液，總反應時間為48h。反應結束后，將混濁液在4500r/min下離心10min，得到沉淀。

酸水解：將酶水解得到的沉淀加入到0.05mol/L HCl的二氧六環(huán)-水（前者與后者體積比85∶15，下同）中，在通N2保護的情況下微沸（103℃左右，油?。┗亓?h；反應液冷卻后用G2玻璃濾器過濾，殘留固體用二氧六環(huán)-水洗滌至無色，合并濾液，在強烈攪拌下用NaHCO3中和；然后將液體緩慢滴入大量pH值為2的水中（水體積是液體體積10倍以上），出現(xiàn)淡黃色沉淀；在4500r/min下離心10min，得到沉淀，用一定體積的二氯甲烷洗滌3次后，冷凍干燥，制得粗木素。

粗木素提純：將粗木素溶于二氧六環(huán)-水中，然后緩慢滴入大量乙醚（10倍體積以上）中，出現(xiàn)淡黃色沉淀；在4500r/min下離心10min，得到沉淀，用乙醚洗滌，冷凍干燥，得到純化木素。

1.4 木素的乙酰化

將純化木素置于帶塞的三角瓶中，加入足量的吡啶和醋酸酐（前者與后者體積比1∶2），用N2排出三角瓶中的空氣，置于暗中反應72h，反應期間不定期振蕩。反應結束后，將液體緩慢滴入大量乙醚（10倍體積以上），析出淺黃色的沉淀，即為乙?；蟮哪舅?。離心分離，并用乙醚洗滌乙?；蟮哪舅刂翢o吡啶味，冷凍干燥備用。

1.5 對木素的分析

木素的分子質量分布在Agilent 1200 series上進行測定，2根凝膠色譜柱為Agilent PL gel 5μm 103?和500?，RID檢測器，流量1.0mL/min柱溫30℃，標線用聚苯乙烯作出，其質均相對分子質量為1490～53500。

木素的TGA分析在TGA Q 500上進行，升溫速率為20℃/min。

木素的FT-IR分析在Bruker Tensor 27上進行，采用KBr壓片法，掃描次數(shù)為16次。

木素的1H-NMR分析和13C-NMR分析是先將乙?；哪舅厝苡贒MSO-d6（含TMS）中，然后在Bruker AV400 NMR上進行。

2 結果與討論

2.1 竹漿木素的GPC分析

漂白各段竹漿殘余木素的GPC分析結果如表1所示。由表1可知，經O段處理后，殘余木素的質均分子質量略有增加，而經LMS段處理后，殘余木素的質均分子質量明顯變小，說明殘余木素在漂白過程中的總體變化趨勢是質均分子質量變小。殘余木素分子質量分布經O段處理后，多分散性變小，說明分子質量分布變窄；經LMS段處理后，殘余木素的分子質量分布反而變得更為分散。

表1 漂白各段竹漿殘余木素的相對分子質量

2.2 竹漿木素的TGA分析

O段和LMS段殘余木素的熱重（TG）曲線及微分（DTG）曲線見圖1。

圖1 O段/LMS段殘余木素的TG和DTG曲線

由圖1a可知，O段殘余木素的熱解過程分為3個區(qū)段：溫度＜210℃時，微分曲線在200.3℃處出現(xiàn)第一個失重峰，主要是樣品中所含水分的去除；在210～600℃范圍內，木素發(fā)生明顯熱解，微分曲線在338.2℃處有較大失重峰，這個峰區(qū)間為木素的主要熱解階段，木素失重達56.2％，600℃處木素的殘余質量為31.6％；溫度＞600℃，熱重曲線平緩，微分曲線在650℃附近出現(xiàn)小的失重峰，為木素的二次熱解。

由圖1b可知，LMS段殘余木素的熱解過程也分為3個區(qū)段：溫度＜159.5℃時，微分曲線在139.1℃處出現(xiàn)一個失重峰，主要是樣品中所含水分的去除；159.5～600℃為木素熱解的主要區(qū)間，木素發(fā)生明顯熱解，微分曲線在194℃處有一個失重峰肩，在245.3℃和335.1℃處有2個主要的失重峰；木素在159.5～298℃峰區(qū)間的失重為22.9％，在298～600℃峰區(qū)間的失重為25.8％，600℃處木素的殘余質量為34.1％；溫度＞600℃，熱重曲線平緩，微分曲線無失重峰。

綜上所述，在LMS段處理前后，竹漿殘余木素的熱解行為明顯不同。LMS段前殘余木素僅在338.2℃處有一主要的失重峰，LMS段后殘余木素除了在該處附近的335.1℃處有一個主要的失重峰外，還在較低溫度245.3℃處出現(xiàn)一個更大的失重峰。可見，經LMS段后，竹漿殘余木素的熱穩(wěn)定性變差，更易在較低溫度下熱解。

2.3 竹漿木素的FT-IR分析

圖2為LMS段殘余木素的FT-IR，各個吸收峰根據參考文獻［3-9］確定，其歸屬見表2。

圖2 LMS段殘余木素的FT-IR

表2 竹漿殘余木素FT-IR吸收峰的歸屬

3470cm-1說明原漿木素、O段和LMS段殘余木素中均存在一定量的游離脂肪族羥基；3130cm-1說明原漿木素和LMS段殘余木素中存在游離酚羥基，而O段殘余木素中幾乎沒有游離酚羥基；3080cm-1說明O段殘余木素中有少量—COOH。對于原漿木素和LMS段殘余木素，3130cm-1比3470cm-1強，說明游離酚羥基比脂肪族羥基多。2940cm-1附近為CH3、CH2、CH的C—H伸縮振動，原漿木素和LMS段殘余木素在此處的吸收類似，但是O段殘余木素的CH3吸收顯著減弱，說明O段中大量的—OCH3被脫除。1767cm-1為芳香乙?；?，1718cm-1為脂肪乙?；?，原漿木素在1767cm-1處有大的吸收峰，說明原漿木素中主要為酚羥基，脂肪族羥基少；O段殘余木素在1743cm-1有大的吸收峰，處于1767～1718cm-1之間，說明乙?；姆恿u基和脂肪族羥基的含量相當，結合3130cm-1處無游離酚羥基，說明O段殘余木素脂肪族羥基比酚羥基稍多；LMS段殘余木素在1743cm-1處有大的吸收峰且峰肩向1767cm-1延伸，說明LMS段殘余木素以脂肪族羥基為主。綜上所述，原漿木素羥基以酚羥基為主，O段殘余木素中脂肪族羥基比酚羥基稍多，而LMS段殘余木素則以脂肪族羥基為主，說明木素在O段和LMS段中，苯環(huán)被持續(xù)破壞，導致酚羥基減少，脂肪族羥基增多。

1685～1652cm-1為共軛CO的吸收，1685cm-1為共軛醛CO，1652cm-1為共軛酮CO；原漿木素中1685cm-1處和1652cm-1處的吸收相當，O段殘余木素相對原漿木素在1652cm-1處的吸收增強，LMS段殘余木素相對O段殘余木素在1685cm-1處的吸收又增強，說明漂白過程中木素先生成共軛酮，然后又生成共軛醛。

對于原漿木素，在1465～1458cm-1、1418cm-1、1400cm-1處為愈創(chuàng)木基（G）上—OCH3的C—H彎曲振動，在1385cm-1、1372cm-1、1338～1331cm-1處為紫丁香基（S）上—OCH3的C—H彎曲振動；原漿木素中G單元—OCH3的吸收比S單元—OCH3的吸收略強，可得G與S的摩爾比大于2∶1，即S單元占木素結構單元的比例不到1/3（以物質的量計），竹子原漿木素的主要結構單元為G單元。

對于LMS段殘余木素，在1465～1455cm-1、1419cm-1、1400cm-1處為G單元上—OCH3的C—H彎曲振動，在1385cm-1、1372cm-1、1333cm-1處為S單元上—OCH3的C—H彎曲振動；G單元的吸收比S單元稍弱，可得G與S的摩爾比小于2∶1，G單元仍為主要結構單元，但S單元占木素結構單元的比例相對原漿木素稍多，即經LMS段后，殘余木素中S單元的含量增多。

在1045cm-1處為CC—O的C—O，在1013cm-1處為Ar-O的C—O，原漿木素和O段殘余木素在該兩處的吸收類似，LMS段殘余木素在1045cm-1處吸收比原漿木素和O段殘余竹漿木素強，而在1013cm-1處變弱，說明LMS段中，木素苯環(huán)被破壞，苯環(huán)轉變成脂肪鏈。

2.4 竹漿木素的1H-NMR分析

圖3 O段/LMS段殘余木素的1H-NMR圖

表3 O段/LMS段殘余木素1H-NMR譜共振峰的歸屬

O段和LMS段殘余木素的1H-NMR圖如圖3所示，圖3中各峰的歸屬根據參考文獻［8-12］確定（見表3）。由表3可知，8#～13#峰為苯環(huán)質子的共振，5#～7#峰為—OCH3的質子共振。由8#～13#峰可知，這2種木素中都含有愈創(chuàng)木基（G）、紫丁香基（S）和對羥基苯基（H）這3種苯丙烷結構單元，LMS段前后竹漿殘余木素為GSH型。1#峰和2#峰為脂肪乙?；?，3#峰為芳香乙?；?，O段殘余木素中，1#峰和2#峰積分面積之和與3#峰積分面積之比為2.5∶1，LMS段殘余木素中，它們的積分面積之比為3∶1，說明經LMS段后，脂肪乙?；龆?，即殘余木素中脂肪族羥基增多，這是由于經LMS段后竹漿殘余木素的破壞增多。5#峰為脂肪鏈—OCH3，6#峰和7#峰為苯環(huán)—OCH3，O段殘余木素中以7#峰為主，而LMS段殘余木素中以5#峰為主，說明LMS段殘余木素中脂肪鏈—OCH3比O段殘余木素的多、苯環(huán)—OCH3比O段殘余木素的少，這是由于LMS段中木素破壞增加。

圖4是O段和LMS段殘余木素苯環(huán)質子區(qū)的比較，從O段到LMS段，代表G單元和S單元的峰的面積之比G/S和G’/S’均變大，說明經LMS段后，竹漿殘余木素S單元相對含量增多；H/G和H’/G’之比均變小，說明經LMS段后，竹漿殘余木素H單元相對含量減少?？梢姡崦?天然介體體系漂白對竹漿木素S單元的破壞較少，而對H單元的破壞和去除則較多。

圖4 O段/LMS段竹漿殘余木素1H-NMR的苯環(huán)質子區(qū)

對1H-NMR譜的相關區(qū)域進行積分，可以由積分面積計算出竹漿殘余木素中主要基團的摩爾比，如表4所示。經LMS段后，殘余木素每個苯丙烷單元對應的甲氧基數(shù)增多，這是因為在LMS段中部分苯環(huán)被破壞后殘留在竹漿中，導致苯環(huán)數(shù)量減少，然而甲氧基卻仍然保留；苯丙烷單元對應的脂肪族羥基顯著增加，也說明LMS段中木素的苯環(huán)被進一步氧化破壞。

表4 木素中各基團的摩爾比

2.5 竹漿木素的13C-NMR分析

LMS段前后竹漿殘余木素的13C-NMR譜如圖5和圖6所示，各峰的歸屬根據參考文獻［4-5，9，11-15］確定（見表5）。

如圖5所示，對于O段殘余木素，1#峰為脂肪乙?；腃O，2#峰為芳香乙?；腃O，前者與后者的積分面積之比大于1，可見，在O段殘余木素中，同時存在脂肪族羥基和酚羥基，脂肪族羥基的含量比酚羥基多。3#峰為酯化紫丁香基（S）的C-3和C-5的共振，4#峰為愈創(chuàng)木基（G）的C-3的共振，6#峰為愈創(chuàng)木基（G）的C-4的共振，7#峰為對羥基苯基（H）的C-4的共振，說明O段殘余木素為GSH型，由3#峰、6#峰與7#峰的積分面積比為1∶2∶1可得，苯丙烷單元S、G、H的摩爾比為0.5∶2∶1（3#峰由2個C的共振產生，而6#峰和7#峰由1個C的共振產生），即O段殘余木素以G單元為主，H單元含量多于S單元含量，說明在O段中—OCH3被大量脫除。

如圖6所示，在LMS段殘余木素中，1#峰與2#峰積分面積之比為1∶0.07，比值遠遠大于1，可見，同時存在脂肪族羥基和酚羥基，且以脂肪族羥基為主，酚羥基非常少。3#峰～7#峰、9#峰～11#峰為苯環(huán)C的共振，可知LMS段殘余木素為GSH型。由化學位移為143.6（H）、148.0～149.7（G）、152.6（S）處的積分得，H、G、S的摩爾比為1∶4.94∶2.78。可見，LMS段殘余木素以G為主；相對于O段殘余木素，LMS段殘余木素S單元增加，H單元減少，與前文FT-IR和13C-NMR的分析結果一致。

從圖6的化學位移為75.3、63.2、62.0、60.7和59.3可知，木素單元之間的連接方式主要有β-1’，β-O-4’和β-5’，它們的積分面積比為1∶2.38∶0.26，則β-1’、β-O-4’和β-5’3種主要連接方式的摩爾分數(shù)（只考慮這3種連接時）依次為27.5％、65.4％、7.1％。在Sakakibara提出的由28個苯丙烷單元構成的針葉木木素的結構模型中，以β-O-4’連接為主，且有3個β-1’和4個β-5’連接；而Nimz提出的由25個苯丙烷單元構成的闊葉木木素模型中，β-1’連接為3個，β-5’連接僅有2個［16］。竹子作為禾本科植物，除以β-O-4’為主的連接外，還有較多的β-1’連接，而β-5’連接較少，這是合理的。

表5 LMS段前后竹漿殘余木素13C-NMR譜中各峰歸屬

綜上所述，竹漿殘余木素中脂肪族羥基多于酚羥基，LMS段殘余木素酚羥基很少。竹漿木素為GSH型，結構單元以G單元為主，O段殘余木素中G＞H＞S（以物質的量計，下同），LMS段殘余木素中G＞S＞H，說明經LMS段后，竹漿木素中S單元增多。苯丙烷單元之間的連接以β-O-4’為主，且有β-1’和β-5’連接，經LMS段后，竹漿木素中β-1’連接的含量增加，而β-5’連接很少。經LMS段后，竹漿殘余木素的破壞加劇，脂肪族羥基增加，H單元的含量減少，G單元的含量略有減少，S單元的含量從27％增至31.9％。

3 結論

3.1 采用GPC分析了硫酸鹽竹漿木素、O段和LMS段的殘余木素。結果表明，原漿木素的質均相對分子質量為11010、O段殘余木素的為12150、LMS段殘余木素的為7374，多分散性依次為1.49、1.03和2.38，可見，隨漂白（O、LMS）的進行，竹漿殘余木素的總體變化趨勢為分子質量降低。

3.2 采用TGA分析了O段和LMS段殘余木素。結果表明，O段殘余木素在338.2℃處有1個主要的失重峰，而LMS段殘余木素在335.1℃處和245.3℃處有2個主要的失重峰。可見，經LMS段處理后，竹漿殘余木素的熱穩(wěn)定性變差，更易在較低溫度下熱解。

3.3 采用FT-IR和1H-NMR分析了原漿木素、O段和LMS段殘余木素。采用13C-NMR分析了O段和LMS段殘余木素。結果表明，竹漿木素為GSH型，結構單元以G為主，苯丙烷單元之間的連接以β-O-4’為主，此外還有β-1’和β-5’連接。原漿木素中，羥基以酚羥基為主，苯丙烷單元中S的含量（以物質的量計，下同）少于1/3；O段殘余木素中，脂肪族羥基比酚羥基多，并有少量—COOH、—OCH3脫除，苯丙烷單元中G＞H＞S；LMS段殘余木素中，羥基以脂肪族羥基為主，S單元含量增加，H單元含量減少，β-1’連接增加，β-5’連接減少。綜上所述，隨漂白（O、LMS）的進行，—OCH3被脫除，苯環(huán)被破壞，脂肪族羥基增多；經LMS段后，竹漿殘余木素中S單元增加，H單元減少。

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