腫瘤免疫治療與化療的協(xié)同效應(yīng)研究現(xiàn)狀

黃純綜述，李凱審校

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院肺部腫瘤內(nèi)科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300060）

腫瘤免疫治療由于其較低的毒性和較高的特異性，長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為是一種很有吸引力的治療手段[1]，其中腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）是最為理想的免疫效應(yīng)細(xì)胞[2]。腫瘤免疫治療主要包括細(xì)胞因子、單克隆抗體、腫瘤疫苗[3]及細(xì)胞過繼免疫治療等。實(shí)體腫瘤免疫主要通過CTL、自然殺傷細(xì)胞（NK）、自然殺傷T細(xì)胞（NKT）等介導(dǎo)殺傷效應(yīng)。樹突細(xì)胞（DCs）在協(xié)調(diào)上述細(xì)胞的過程中扮演重要角色。而腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞（MDSC）又形成了一個(gè)抑制免疫效應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)，在免疫抑制因素存在時(shí)如何有效誘導(dǎo)抗腫瘤T細(xì)胞效應(yīng)一直備受關(guān)注。然而，單一CTL免疫治療在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中未能展示其突出的臨床療效[4]。化療是惡性腫瘤傳統(tǒng)的治療方法之一，它能夠殺死增殖活躍的腫瘤細(xì)胞，但化療通常對(duì)免疫系統(tǒng)有抑制作用[5]。因此，CTL聯(lián)合化療這種治療模式一直被多數(shù)學(xué)者認(rèn)為不甚合理。近年來(lái)的臨床研究表明，免疫治療聯(lián)合化療能夠使部分患者臨床獲益，所以聯(lián)合治療這種模式再次受到重視[6]。然而，二者聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的具體機(jī)制仍不甚清楚。

1 化療對(duì)免疫系統(tǒng)的作用

大多數(shù)化療藥物能夠殺死快速分裂細(xì)胞，包括免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞。強(qiáng)烈的化療可致淋巴細(xì)胞減少及循環(huán)T細(xì)胞比例下降[7]。有證據(jù)表明，經(jīng)典化療方法可降低T細(xì)胞功能，最終降低抗腫瘤免疫效應(yīng)[7]。Spisek等[8]的研究表明，蛋白酶體抑制劑硼替佐米可誘導(dǎo)細(xì)胞表面的HSP90表達(dá)。后者（HSPs）是一個(gè)危險(xiǎn)信號(hào)，對(duì)DCs來(lái)說(shuō)其意味著向外傳遞了“吃我”的信息[9]。但非細(xì)胞毒劑量的化療藥物，如紫杉醇、阿霉素、絲裂霉素C和氨甲喋呤等，卻以一種IL-12依賴的自分泌模式增加了腫瘤抗原的遞呈[10]。DCs經(jīng)長(zhǎng)春新堿處理之后歷經(jīng)成熟，其誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的能力明顯增強(qiáng)[11]?；熞餐ㄟ^直接影響腫瘤細(xì)胞的方式誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)，使得致免疫原性細(xì)胞死亡[12]，并可使腫瘤細(xì)胞更易被CTL殺傷；有數(shù)據(jù)顯示5-Fu、CPT-11和DDP可以增加結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480被T細(xì)胞殺傷的敏感性[13]?；熯€可去除MDSC和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而消減腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制因素[14]。

免疫原性是指能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力，化療藥物可通過諸多細(xì)胞反應(yīng)來(lái)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性。用蒽環(huán)類化療藥物處理腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的鈣網(wǎng)蛋白可轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面來(lái)介導(dǎo)免疫反應(yīng)，促使樹突狀細(xì)胞激發(fā)腫瘤特異性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)[15]。化療藥物還可通過調(diào)節(jié)腫瘤抗原表達(dá)的質(zhì)或量，來(lái)改變腫瘤細(xì)胞的免疫原性。Ramakrishnan等[16]通過激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)化療藥物可以誘導(dǎo)B16F10、U266腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬?；熕幬锊粌H可以直接殺死腫瘤細(xì)胞，也可以通過誘發(fā)自噬導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的應(yīng)激和死亡，而后者更加具有免疫原性繼而激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)[17]。因此，那些處于應(yīng)激狀態(tài)并即將死亡的腫瘤細(xì)胞可以被看作是一種“治療性疫苗”來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫進(jìn)而控制殘余的腫瘤細(xì)胞[18]。Michaud等[19]指出，自噬對(duì)于化療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡不是必要的，但對(duì)于增加免疫原性是必要的?；熀竽切┯心芰Πl(fā)生自噬的腫瘤能夠誘導(dǎo)樹突細(xì)胞和T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤床。

綜上，化療可增加腫瘤抗原的遞呈。細(xì)胞毒藥物能通過調(diào)節(jié)全身免疫抑制因素或降低某些細(xì)胞數(shù)量而導(dǎo)致抗原特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增。化療藥物可通過多種途徑來(lái)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性。較低的非細(xì)胞毒劑量的化療藥物可改善機(jī)體免疫功能，但傳統(tǒng)劑量的化療藥物是否可以增加免疫治療效應(yīng)尚存爭(zhēng)議。

2 免疫治療聯(lián)合化療是否可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)

免疫治療不僅能重建人體免疫系統(tǒng)，保護(hù)患者機(jī)體平衡不受破壞，還能有效克服化療耐藥等難題。例如，干擾素聯(lián)合化療治療慢性粒細(xì)胞白血病可減低化療藥物的劑量?；熀筒煌[瘤疫苗的聯(lián)合使用可有效提高臨床有效率[20]。胰腺癌患者注射DC疫苗后再用吉西他濱進(jìn)行化療，可顯著降低腫瘤的生長(zhǎng)并提高胰腺癌患者的生存率[21]。用抗CTLA-4的單克隆抗體聯(lián)合化療治療小細(xì)胞肺癌的II期臨床試驗(yàn)中，相比單獨(dú)化療，聯(lián)合治療顯示出更好的抗腫瘤效果[22]。

在前期工作中[16,23]，本研究團(tuán)隊(duì)以B16F10惡性黑色素瘤小鼠模型作為研究對(duì)象，選用從Pmel-1轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟分離獲得的Pmel T細(xì)胞進(jìn)行免疫治療（其可以識(shí)別B16F10細(xì)胞上gp100抗原表位），以紫杉醇12.5mg/kg（非細(xì)胞毒劑量）進(jìn)行化療。結(jié)果表明，單獨(dú)給予T細(xì)胞或紫杉醇雖可抑制腫瘤生長(zhǎng)，但停止治療后1周又繼續(xù)增長(zhǎng)；兩者聯(lián)合治療的抗腫瘤效應(yīng)顯著增強(qiáng)。在第2個(gè)模型中，我們將表達(dá)Neu癌基因的TUBO乳腺癌細(xì)胞接種至BALB/c小鼠皮下，以負(fù)載Neu來(lái)源肽的DC疫苗進(jìn)行免疫治療。同樣，單一治療作用微弱，而DC疫苗聯(lián)合紫杉醇的抗腫瘤效果顯著。在第3個(gè)模型中，筆者將表達(dá)雞OVA的EG-7淋巴瘤細(xì)胞接種至小鼠皮下，使用OVA來(lái)源的肽（SINFEKL）免疫小鼠，從小鼠脾臟分離純化獲得T細(xì)胞進(jìn)行過繼性免疫治療。T細(xì)胞或紫杉醇單獨(dú)應(yīng)用均使腫瘤輕微縮小，二者聯(lián)合顯著增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)。

3 免疫治療聯(lián)合化療產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的分子機(jī)制

給小鼠注射紫杉醇后，CTL穿透腫瘤實(shí)質(zhì)的能力增加。這可能歸咎于化療可破壞腫瘤間質(zhì)細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予非細(xì)胞毒劑量的化療藥物可以使腫瘤細(xì)胞對(duì)CTL介導(dǎo)的殺傷作用更加敏感。盡管紫杉醇、阿霉素、順鉑3種藥物作用機(jī)制不甚相同，但它們均可誘導(dǎo)上述現(xiàn)象。

CTL可通過包括 IFN-γ、Fas/FasL[24]以及穿孔素/顆粒酶B[25]等機(jī)制發(fā)揮細(xì)胞毒作用。IFN-γ能殺傷腫瘤細(xì)胞，但其在誘導(dǎo)程序性死亡的過程中扮演何種角色尚不得知。在體內(nèi)腫瘤模型中，NK和NKT細(xì)胞能夠產(chǎn)生IFN-γ對(duì)抗腫瘤生長(zhǎng)，但只能引發(fā)有限的腫瘤細(xì)胞死亡。IFN-γ可促進(jìn)某些細(xì)胞因子如CXCL10產(chǎn)生而幫助在腫瘤部位募集免疫細(xì)胞，還可與IL-12一起通過活性氧簇和氮的中間產(chǎn)物在凋亡過程中發(fā)揮作用[26]。IFN-γ通過上調(diào)HT29腫瘤細(xì)胞表面Fas和Fas L而誘導(dǎo)凋亡[27]。Kiefer等[28]認(rèn)為IFN-γ能夠通過直接或是間接的方式誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因，調(diào)控不依賴p53的凋亡途徑。在前期研究中，本研究團(tuán)隊(duì)試圖證實(shí)聯(lián)合治療效果與IFN-γ誘導(dǎo)的凋亡存在相關(guān)，但結(jié)果顯示IFN-γ的水平在對(duì)照組和治療組之間沒有顯著性差異。

Fas通路是廣為人知的誘導(dǎo)凋亡通路，其涉及效應(yīng)細(xì)胞表面上的FasL和靶細(xì)胞表面上的Fas受體（CD95）。FasL通過三聚作用結(jié)合并激活受體。被激活的受體可以募集一些銜接分子，如Fas相關(guān)的死亡受體蛋白（FADD），從而進(jìn)一步激活procaspase8。Caspase 8通過BID或是細(xì)胞色素C途徑激活caspase 3，最終導(dǎo)致DNA斷裂[29]。本研究團(tuán)隊(duì)評(píng)估了3種藥物（紫杉醇、順鉑、阿霉素）治療后腫瘤細(xì)胞表面上Fas的表達(dá)和脾細(xì)胞表面上FasL的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，以上藥物均未改變Fas或是FasL的表達(dá)，卻顯著增加了顆粒酶B對(duì)靶細(xì)胞膜的通透性。所有嘗試的細(xì)胞毒藥物也都增加了人腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞內(nèi)顆粒酶B的水平[23]。除此之外，抑制顆粒酶B的活性降低了紫杉醇對(duì)CTL誘導(dǎo)的凋亡作用，從而證實(shí)了化療聯(lián)合CTL的協(xié)同作用是通過上述關(guān)鍵機(jī)制發(fā)揮作用的[23]。

CTL和NK細(xì)胞通常利用接觸依賴性機(jī)制殺傷惡性腫瘤細(xì)胞。當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞接觸靶細(xì)胞之后，CTL釋放生孔蛋白、穿孔素和絲氨酸激酶的一個(gè)家族成員（顆粒酶）[30-31]。顆粒酶B是顆粒酶家族中研究最多也是最重要的成員。顆粒酶B既可以誘導(dǎo)caspase依賴，也可誘導(dǎo)caspase非依賴的細(xì)胞死亡。顆粒酶B可以間接的通過BCL-2家族中的促凋亡成員BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白（BID）進(jìn)而引發(fā)caspase激活[32-33]。此外，其也可以通過不依賴BID的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[34]。

最初人們認(rèn)為穿孔素扮演一個(gè)管道角色，通過將自己插入細(xì)胞膜而產(chǎn)生一個(gè)通道，使顆粒酶B被動(dòng)地穿過[35]。但最近的研究表明其并非是靶細(xì)胞攝取顆粒酶B的唯一機(jī)制。有證據(jù)顯示顆粒酶B穿入細(xì)胞可以被受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用控制[36]。其中介導(dǎo)顆粒酶B攝入細(xì)胞最主要的受體之一是甘露糖6磷酸受體（M6PR）[37]。人類的M6PR基因定位于6q26,該基因編碼的M6PR蛋白是單鏈跨膜受體，在所有的組織細(xì)胞中都表達(dá)，90%位于細(xì)胞內(nèi)，其余分布在細(xì)胞膜。M6PR可與兩種類型的配體結(jié)合，一種是胰島素樣生長(zhǎng)因子2（insulin-like growth factor II，IGF-II），另一種是含有6-磷酸甘露糖糖基的蛋白質(zhì)。該受體的基本功能是在細(xì)胞內(nèi)將磷酸甘露糖酰糖蛋白從高爾基體運(yùn)到溶酶體，以及將包括IGF-II在內(nèi)的細(xì)胞外配體內(nèi)化并轉(zhuǎn)運(yùn)至到溶酶體中進(jìn)行降解。在前期體外研究中本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)紫杉醇、順鉑、阿霉素均可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面M6PR，同時(shí)顆粒酶B也被更多攝入腫瘤細(xì)胞[16]。因此推斷化療通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面M6PR增強(qiáng)了CTL免疫治療的效果。應(yīng)用特異性M6PR shRNA下調(diào)腫瘤細(xì)胞M6PR的表達(dá)導(dǎo)致經(jīng)紫杉醇預(yù)處理的腫瘤細(xì)胞攝取顆粒酶B顯著下降，表明上調(diào)M6PR能夠使腫瘤細(xì)胞對(duì)CTL的細(xì)胞毒作用更加敏感[16]。筆者使用紫杉醇、阿霉素預(yù)處理CTL 18 h，并測(cè)量CTL對(duì)EL-4腫瘤靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。經(jīng)紫杉醇預(yù)處理后，CTL的特異性細(xì)胞毒作用沒有增強(qiáng)，阿霉素反而使CTL作用減弱。但是，當(dāng)CTL和腫瘤細(xì)胞同時(shí)經(jīng)過紫杉醇處理后，細(xì)胞毒效應(yīng)明顯增加。這提示化療不能直接增強(qiáng)CTL的細(xì)胞毒作用。隨后，應(yīng)用缺乏穿孔素表達(dá)的CTL來(lái)處理腫瘤靶細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些CTL不能殺死未經(jīng)化療預(yù)處理的靶細(xì)胞，但可以有效地殺死經(jīng)過化療處理過的腫瘤細(xì)胞。以上結(jié)果表明，化療可通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞M6PR調(diào)節(jié)顆粒酶B的攝取并降低了細(xì)胞毒殺傷過程對(duì)穿孔素的需求。

4 結(jié)語(yǔ)

惡性腫瘤的免疫治療聯(lián)合化療可以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。化療藥物可通過多種途徑來(lái)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性。非細(xì)胞毒劑量的化療可增加腫瘤抗原的遞呈，還可下調(diào)MDSC、Treg等免疫抑制因素進(jìn)而導(dǎo)致抗原特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增。目前，免疫治療與化療協(xié)同效應(yīng)的分子機(jī)制仍有很多盲點(diǎn)。通過前期研究，本研究團(tuán)隊(duì)提出了一個(gè)新的機(jī)制來(lái)闡述CTL與化療在腫瘤治療中的協(xié)同作用。在單一免疫治療中，由腫瘤疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生或是體外誘導(dǎo)培養(yǎng)并輸入患者的CTL能穿透進(jìn)入腫瘤實(shí)質(zhì)并接觸到表達(dá)抗原的腫瘤細(xì)胞，CTL被激活后釋放穿孔素和顆粒酶B而殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，免疫治療的效應(yīng)由滲透進(jìn)入腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)的CTL以及表達(dá)特異性抗原的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量共同決定。這個(gè)免疫激發(fā)的過程還與腫瘤微環(huán)境中的諸多免疫抑制細(xì)胞相拮抗，單一免疫治療后通常只能在有限的患者中檢測(cè)到抗腫瘤免疫反應(yīng)?；熆善茐哪[瘤基質(zhì)從而導(dǎo)致更多的CTL穿透進(jìn)入腫瘤實(shí)質(zhì)，也可抑制腫瘤微環(huán)境中的負(fù)性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。更重要的是，化療上調(diào)了腫瘤細(xì)胞表面M6PR的表達(dá)，隨后被激活的CTL所釋放出來(lái)的顆粒酶B可以被大量的臨近的腫瘤細(xì)胞所攝取。因此，相對(duì)較少數(shù)量的CTL可以導(dǎo)致大量腫瘤細(xì)胞凋亡。該機(jī)制仍需要在動(dòng)物模型以及腫瘤患者中進(jìn)一步驗(yàn)證。

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