• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    橙皮苷對化學性肝纖維化大鼠α-SMA表達的影響

    2015-02-01 03:43:42吳芙蓉何曉麗李培芳
    安徽醫(yī)藥 2015年12期
    關(guān)鍵詞:肝纖維化

    吳芙蓉,姜 玲,何曉麗,張 瓊,李培芳,王 靜,姜 輝

    (1.安徽省立醫(yī)院藥劑科,安徽 合肥 230001;

    2. 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部,安徽 合肥 230031)

    ?

    ◇藥學研究◇

    橙皮苷對化學性肝纖維化大鼠α-SMA表達的影響

    吳芙蓉1,姜玲1,何曉麗1,張瓊1,李培芳1,王靜1,姜輝2

    (1.安徽省立醫(yī)院藥劑科,安徽 合肥230001;

    2. 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部,安徽 合肥230031)

    摘要:目的 觀察橙皮苷對化學性肝纖維化大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表達的影響,探討其可能的作用機制。方法 采用50%四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)每周2次,連續(xù)12周皮下注射的方法,誘導肝纖維化大鼠模型。造模后第7周,每天按50,100,200 mg·kg-1灌胃給予不同劑量的橙皮苷(hesperidin,HDN)和秋水仙堿(0.1 mg·kg-1),共6周。末次給藥后,禁食8 h,處置大鼠,分光光度法檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和肝組織羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)的含量;取固定部位肝臟組織,HE和Masson染色觀察肝組織病理損傷程度,免疫組化和RT-PCR技術(shù)檢測肝組織中α-SMA蛋白與mRNA的表達。結(jié)果 與模型組相比,HDN (100,200 mg·kg-1)組不僅可改善大鼠肝纖維化損傷程度,降低ALT、AST、Hyp含量(P<0.05或P<0.01),還可減少肝組織中α-SMA蛋白與mRNA的表達(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 HDN對化學性肝纖維化大鼠具有很好的保護作用,其機制可能與抑制肝星狀細胞的活化、增殖有關(guān)。

    關(guān)鍵詞:橙皮苷;肝纖維化;大鼠;α-平滑肌肌動蛋白

    肝纖維化是一種常見病,多發(fā)病,是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段,屬可逆病變[1-2]。橙皮苷(hesperidin,HDN) 為二氫黃酮苷類化合物,具有抗炎、抗氧化、護肝等諸多藥理作用[3-4]。本實驗以前期研究為基礎(chǔ)[5-6],觀察橙皮苷對肝纖維化大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的影響,探討其可能的作用機制。

    1材料和方法

    1.1藥物橙皮苷,純度為80%,Sigma公司,批號:50162;秋水仙堿,西雙版納藥業(yè)有限責任公司,批號:20130307。

    1.2動物SD大鼠,♂,體質(zhì)量(200±20)g,SPF級,購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心,準字號:Scxk(皖)2011-002。

    1.3試劑丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)試劑盒,南京建成生物工程研究所;兔抗鼠α-SMA單克隆抗體,河北博海生物工程開發(fā)有限公司;PCR試劑盒,F(xiàn)ermentas公司。

    1.4儀器1510型全波段酶標儀,美國熱電公司;2306型顯微鏡,麥克奧迪實業(yè)集團有限公司;基因擴增儀、圖像分析管理系統(tǒng),珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司。

    1.5方法

    1.5.1模型復制[7]雄性SD大鼠,按隨機數(shù)字表分為正常組、模型組、HDN 3個不同劑量組和陽性藥組,每組10只。按0.1 mL/100 g背部皮下注射50%CCl4(CCl4與橄欖油等體積混合),每周2次,持續(xù)12周,復制肝纖維動物模型。造模后第7周,灌胃給予50,100,200 mg·kg-1不同劑量的橙皮苷和秋水仙堿(0.1 mg·kg-1),每天1次,連續(xù)6周。

    1.5.2血清ALT、AST的檢測末次給藥后,禁食8 h,麻醉大鼠,腹主動脈采血,室溫靜置2~3 h,4 000 r·min-1,離心15 min,分離血清,分光光度法檢測血清ALT、AST的含量。

    1.5.3肝組織Hyp含量測定取相同部位肝組織,稱重,加生理鹽水制成10%的肝組織勻漿,分光光度法檢測肝組織中Hyp的含量。

    1.5.4肝組織病理組織學檢查取同一部位肝臟組織,加4%多聚甲醛液固定,分別進行HE和Masson染色。

    1.5.5免疫組化技術(shù)測定肝組織中α-SMA蛋白的表達按試劑盒說明書進行免疫組織化學染色,光鏡下觀察、拍照,并結(jié)合陽性細胞百分比(a)及陽性細胞染色強弱(b),以IHS=a×b為指標,對其進行半定量分析[8]。

    1.5.6RT-PCR測定肝組織中α-SMA mRNA的表達[9]采用TRIzol法抽提肝組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。α-SMA Forward:5’-TGGCCACTGCTGCTTCCTTCTTCTT-3’;Reverse:5’-GGGGCCAGCTTCGTCATACTCCTA-3’。按試劑盒說明書進行擴增反應(yīng),并進行凝膠電泳,攝像,以目標條帶與β-actin的比值作為其相對表達量。

    2結(jié)果

    2.1橙皮苷對肝纖維化大鼠血清ALT、AST含量的影響模型組大鼠血清ALT、AST含量較正常組顯著升高(P<0.01);給予藥物干預6周后,橙皮苷(100,200 mg·kg-1)和秋水仙堿組與模型組相比,可顯著降低血清ALT、AST含量(P<0.05或P<0.01);橙皮苷(50 mg·kg-1)組血清ALT、AST含量無顯著性改變(P>0.05),結(jié)果見表1。此外,將各組ALT、AST指標數(shù)據(jù),按其總均值轉(zhuǎn)化為兩分類資料,低水平組(小于均數(shù)組)和高水平組(大于等于均數(shù)組),再行Cochran Armitage 趨勢檢驗,ALT呈現(xiàn)顯著下降趨勢,趨勢χ2=6.63,P=0.001 0,AST趨勢檢驗不具有顯著性意義,見圖1。

    2.2橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織Hyp含量的影響模型組肝組織中Hyp含量較正常組顯著升高(P<0.01);橙皮苷(100,200 mg·kg-1)和秋水仙堿組肝組織Hyp含量較模型組顯著下降(P<0.05或P<0.01);橙皮苷(50 mg·kg-1)組Hyp含量與模型組比較無顯著性改變(P>0.05),結(jié)果見表2。此外,仿前法進行了Cochran Armitage 趨勢檢驗,結(jié)果不顯著(趨勢χ2=3.30,P=0.069),見圖2。

    2.3橙皮苷對肝纖維化大鼠肝臟病理組織學改變的影響HE染色下,正常組大鼠肝細胞、肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝索排列整齊,無膠原纖維增生;模型組大鼠肝臟有大量的脂肪變性、炎性細胞浸潤,細胞核消失,并形成空泡,膠原結(jié)締組織增生;給予HDN和秋水仙堿干預后,肝組織病理損傷程度有好轉(zhuǎn)的趨勢,結(jié)果見圖3。Masson 染色下,正常組大鼠肝臟僅見匯管區(qū)周圍有少量細小的藍色膠原纖維;模型組大鼠肝臟有大量藍色膠原纖維增生,將肝小葉分隔成大小不等的假小葉;給予HDN和秋水仙堿灌胃干預后,各給藥組膠原沉積、結(jié)締組織增生情況明顯減少,結(jié)果見圖4。

    2.4橙皮苷對肝纖維化大鼠α-SMA蛋白表達的影響α-SMA蛋白免疫組化染色以棕黃色為陽性表達。免疫組化染色與IHS評分結(jié)果顯示,α-SMA在正常組大鼠肝臟中呈低表達,在模型組大鼠肝臟中呈廣泛性高表達;與正常組相比,模型組IHS評分顯著高于正常組(P<0.01);與模型組相比,給予藥物干預6周后,橙皮苷(100,200 mg·kg-1)和秋水仙堿組α-SMA陽性表達量與IHS評分顯著降低(P<0.05或P<0.01);橙皮苷(50 mg·kg-1)組α-SMA陽性表達量與IHS評無顯著性改變(P>0.05),結(jié)果見圖5、表3。仍仿前法,進行Cochran Armitage 趨勢檢驗,結(jié)果無統(tǒng)計學意義(趨勢χ2=2.45,P=0.118),見圖6。

    2.5橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織中α-SMA mRNA表達的影響RT-PCR結(jié)果顯示,模型組大鼠肝臟中α-SMA mRNA表達較正常組顯著升高(P<0.01);給予藥物干預6周后,橙皮苷(100,200 mg·kg-1)和秋水仙堿組α-SMA mRNA表達較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01);橙皮苷(50 mg·kg-1)組肝組織中α-SMA mRNA表達無顯著性改變(P>0.05),結(jié)果見圖7。

    表1 橙皮苷對肝纖維化大鼠血清ALT、AST含量的影響

    表2 橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織Hyp含量的影響

    圖2不同劑量橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織

    Hyp含量的影響

    表3 橙皮苷對肝纖維化大鼠α-SMA蛋白表達的IHS評分的影響

    圖7橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織中α-SMA mRNA表達的影響

    3討論

    肝纖維化以細胞外基質(zhì)過度沉積為主要病理學特征,是向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段,屬于可逆病變[10]。CCl4誘發(fā)的肝纖維化動物模型,具有病變典型、模型成功率高、簡便、價廉、耗時短等優(yōu)點,是常用的經(jīng)典肝纖維化動物模型之一,廣泛應(yīng)用于防治肝纖維化藥物的篩選與作用機制的研究[11-12]。

    Hyp是膠原蛋白所特有的氨基酸,可反映膠原代謝的變化情況,與肝纖維化程度相平行,是評估膠原蛋白含量和肝纖維化程度的常用指標[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),連續(xù)皮下注射50%CCl412周后,模型組大鼠Hyp含量顯著升高,HE染色亦顯示肝小葉結(jié)構(gòu)遭破壞,肝索排列紊亂,結(jié)締組織增生,并形成假小葉,表明肝纖維化模型復制成功;給予橙皮苷和秋水仙堿干預6周后,各給藥組Hyp含量顯著下降,肝組織損傷程度明顯減輕,提示橙皮苷對化學性肝纖維化大鼠具有很好的保護作用。

    生理情況下,ALT、AST主要存在于肝臟細胞中,血清中含量較少。CCl4進入體內(nèi)后,肝細胞遭到破壞,ALT、AST大量滲入血液,使血中含量升高。因此,血中ALT、AST的含量可反映肝損害的程度[14-15]。本研究顯示,橙皮苷干預6周后,能顯著降低血清中ALT、AST水平,提示橙皮苷能夠有效的改善肝纖維化大鼠的肝功能。

    研究表明,肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)的過度激活、增殖是肝纖維化形成的關(guān)鍵[16]。HSC激活后,轉(zhuǎn)變成具有增生活性、可產(chǎn)生纖維的肌成纖維細胞,表達α-SMA,并合成大量細胞外基質(zhì)。因此,α-SMA可作為HSC活化的相對特異性標志[17]。本研究發(fā)現(xiàn),給予橙皮苷干預6周后,各給藥組大鼠肝組織中α-SMA蛋白和mRNA水平均顯著下降,提示橙皮苷對HSC活化有一定的抑制作用。

    綜上,橙皮苷具有很好的抗化學性肝纖維化作用,其機制可能與抑制HSC的活化、增殖,從而減少膠原的合成有關(guān)。

    參考文獻:

    [1]Hong IH,Park SJ,Goo MJ,et al. JNK1 and JNK2 regulate alpha-SMA in hepatic stellate cells during CCl4-induced fibrosis in the rat liver[J].Pathology International,2013,63(10):483-491.

    [2]Yoon H,Lee JG,Yoo JH,et al.Effects of metabolic syndrome on fibrosis in chronic viral hepatitis[J].Gut and Liver,2013,7(4):469-474.

    [3]許樹軍,朱琪,于子惠,等.橙皮苷及橙皮素清除超氧陰離子自由基能力的研究[J].中醫(yī)藥學報,2015,43(1):56-58.

    [4]黃文劍,陳茂劍,孫婷,等.橙皮苷對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用[J].廣東醫(yī)學,2014,35(20):3136-3139.

    [5]吳芙蓉,李俊,任丹陽,等.橙皮苷抗大鼠肝纖維化作用的實驗研究[J]. 安徽醫(yī)科大學學報,2011,46(4):358-361.

    [6]李曉冬,李俊,李榮,等.橙皮苷對刀豆蛋白A致小鼠免疫性肝損傷的保護作用[J].安徽醫(yī)科大學學報,2010,45(3):350-353.

    [7]姜輝,高家榮,陳金鋒,等.疏肝健脾方對肝纖維化大鼠肝組織Bcl-2、Bax表達的影響[J].中藥材,2013,36(5):776-780.

    [8]Oslow RA,Dannenberg AJ,Rush D,et al.Cox-2 is expressed in human pulmonary,colonic,and mammary tumors[J].Cancer,2000,89(12):2637-2645.

    [9]姜輝,高家榮,張家富,等.肝樂顆粒對肝纖維化大鼠肝組織α-平滑肌肌動蛋白表達的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2010,17(s1):33-34.

    [10] Demiroren K,Dogan Y,Kocamaz H,et al.Protective effects of L-carnitine, N-acetylcysteine and genistein in an experimental model of liver fibrosis[J].Clin Res Hepatol Gastroenterol,2014,38(1):63-72.

    [11] Kim JH,Jeong YJ,Hong JM,et al. Chronic vitamin C insufficiency aggravated thioacetamide -induced liver fibrosis in gulo-knockout mice[J].Free Radic Biol Med,2014,67:81-90.

    [12] 姜輝,高家榮,陳金鋒,等.三七總皂苷對肝纖維化大鼠肝臟保護作用的實驗研究[J].中國臨床藥理學與治療學,2013,18(10):1116-1120.

    [13] 李林林,龔國清,馮貽東,等.木犀草素對四氯化碳致大鼠肝纖維化的保護作用及其機制研究[J].中國生化藥物雜志,2010,31(6):377-380.

    [14] 吳芙蓉.橙皮苷抗大鼠肝纖維化作用及對TGF-β/Smad信號通路的影響[D].合肥:安徽醫(yī)科大學,2011.

    [15] 呂紀華,鄧聿胤,劉瑛,等.乙肝清對小鼠急性肝損傷的保護作用[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(6):253-256.

    [16] Ahmad A,Ahmad R. Understanding the mechanism of hepatic fibrosis and potential therapeutic approaches[J].Saudi J Gastroenterol,2012,18(3):155-167.

    [17] 邵佳亮, 胡國信,鄭潔,等.羥基喜樹堿對肝纖維化大鼠肝組織Bax、Bcl-2基因和α-SMA蛋白表達及肝纖維化的影響[J].第二軍醫(yī)大學學報,2014,35(4):399-405.

    doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.006

    基金項目:國家自然科學基金(No 81102874)

    (收稿日期:2015-09-08,修回日期:2015-10-15)

    Effect of HDN on the expression of α-SMA in rats’ livers with
    hepatic fibrosis

    WU Fu-rong, JIANG Ling, HE Xiao-li, et al

    (DepartmentofPharmacy,AnhuiProvincialHospital,Hefei,Anhui230001,China)

    Abstract:Objective To observe the effect of hesperidin (HDN) on α-smooth muscle actin (α-SMA) expressions in livers of hepatic fibrosis rats and to explore the underlying mechanisms. Methods SD rats were randomized into control group, model group, HDN (50, 100, 200 mg·kg-1) groups and colchicines (0.1 mg·kg-1) group. Rat with liver fibrosis was induced by hypodermic injection carbon tetrachloride (CCl4), twice a week for 12 weeks. Then different doses of HDN and colchicine were administrated via gavage once a day from week 7 to 12 after liver fibrosis was induced. At the end of experiment, the levels of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), and hydroxyproline (Hyp) were measured by chromatometry. Meanwhile, liver samples were taken to examine the degree of liver fibrosis by HE and Masson. Moreover, the expressions of α-SMA in liver were observed by immunohistochemistry and transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results As compared with the model group, HDN (100, 200 mg·kg-1) not only obviously improved histopathological change, but also degraded the contents of ALT, AST and Hyp(P<0.05 or P<0.01). Meanwhile, HDN could effectively prevent the protein and mRNA expression of α-SMA(P<0.05 or P<0.01). Conclusion HDN has a powerful protective effect on liver fibrosis in rats, which might be partly associated with its effects on inhibiting the activation and proliferation of HSC.

    Key words:hesperidin;liver fibrosis;rat;α-SMA

    猜你喜歡
    肝纖維化
    復方鱉甲軟肝片聯(lián)合恩替卡韋對慢性乙型肝炎肝纖維化患者的臨床分析
    自擬軟肝煎治療慢性乙肝纖維化正虛血瘀證45例療效觀察
    NF—κB信號通路抗肝纖維化的研究進展
    肝纖維化無創(chuàng)診斷的研究現(xiàn)狀
    扶正化瘀制劑抗肝纖維化和治療慢性肝病的臨床療效
    扶正化瘀方抗肝纖維化的主要作用機制與效應(yīng)物質(zhì)
    中西醫(yī)結(jié)合抗肝纖維化的研究思路與方法
    肝纖維化早期診斷進展
    RNA干擾技術(shù)在肝星狀細胞活化信號通路的應(yīng)用
    慢性乙型肝炎患者天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶/血小板指數(shù)在肝纖維化分級中的臨床意義
    欧美日韩在线观看h| 丝瓜视频免费看黄片| 日本av免费视频播放| 亚洲久久久国产精品| 美女高潮的动态| 国产黄片视频在线免费观看| 国产爱豆传媒在线观看| 国产精品.久久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲国产精品专区欧美| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲四区av| 我要看日韩黄色一级片| 少妇丰满av| 97超碰精品成人国产| 中文字幕免费在线视频6| 久久久久人妻精品一区果冻| 免费观看的影片在线观看| 制服丝袜香蕉在线| 另类亚洲欧美激情| 中文字幕亚洲精品专区| 2021少妇久久久久久久久久久| 激情五月婷婷亚洲| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品亚洲成国产av| 国产乱来视频区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 午夜激情久久久久久久| 看非洲黑人一级黄片| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲无线观看免费| 在线观看人妻少妇| 日本黄色片子视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 黑人高潮一二区| 日韩人妻高清精品专区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 97在线人人人人妻| 99热全是精品| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 免费少妇av软件| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美成人a在线观看| 嫩草影院新地址| 欧美精品一区二区免费开放| 国产又色又爽无遮挡免| 精品亚洲成a人片在线观看 | 国产有黄有色有爽视频| 日本黄色日本黄色录像| 国产精品人妻久久久久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲高清免费不卡视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久久韩国三级中文字幕| 日韩强制内射视频| 一级片'在线观看视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美人与善性xxx| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 一级爰片在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 一区二区三区四区激情视频| 97超视频在线观看视频| 国产精品成人在线| 熟女电影av网| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲最大成人中文| 国产探花极品一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| av线在线观看网站| 亚洲av不卡在线观看| 久热久热在线精品观看| 国产精品一二三区在线看| 国产乱来视频区| 嘟嘟电影网在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 日韩欧美精品免费久久| 嫩草影院新地址| 国产综合精华液| 国国产精品蜜臀av免费| 国产精品av视频在线免费观看| 久久99精品国语久久久| 永久免费av网站大全| 久久国产精品大桥未久av | 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | av在线蜜桃| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美+日韩+精品| 午夜免费观看性视频| 一级爰片在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 最近中文字幕高清免费大全6| 欧美精品一区二区免费开放| 国产av码专区亚洲av| 亚洲欧美日韩东京热| 午夜视频国产福利| 日韩视频在线欧美| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 如何舔出高潮| 99热这里只有精品一区| 最近的中文字幕免费完整| 大香蕉97超碰在线| 男男h啪啪无遮挡| 国产综合精华液| 亚洲国产精品一区三区| 成人影院久久| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 美女国产视频在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久久久久久久久免费av| 欧美人与善性xxx| 熟女av电影| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 赤兔流量卡办理| 中文字幕久久专区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲成人一二三区av| 亚洲成人一二三区av| 秋霞在线观看毛片| a 毛片基地| 亚洲精品456在线播放app| 欧美成人精品欧美一级黄| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 91精品国产九色| av免费观看日本| 免费黄网站久久成人精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 一区二区三区乱码不卡18| 一区二区三区四区激情视频| 一级二级三级毛片免费看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 激情 狠狠 欧美| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 哪个播放器可以免费观看大片| 在线观看一区二区三区| 少妇人妻一区二区三区视频| 这个男人来自地球电影免费观看 | 久久久久国产网址| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品国产av在线观看| 免费少妇av软件| 精品亚洲成国产av| av在线老鸭窝| 国产久久久一区二区三区| 丝瓜视频免费看黄片| 国产v大片淫在线免费观看| 国产久久久一区二区三区| 老熟女久久久| 国产高清三级在线| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲性久久影院| 国产成人一区二区在线| 日韩成人伦理影院| 人妻一区二区av| 国产又色又爽无遮挡免| 国产在线视频一区二区| 亚洲色图av天堂| av在线观看视频网站免费| 国产精品偷伦视频观看了| 久久国产乱子免费精品| 国产成人91sexporn| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久97久久精品| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 五月天丁香电影| 水蜜桃什么品种好| 简卡轻食公司| 天堂俺去俺来也www色官网| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 高清毛片免费看| 在线观看一区二区三区激情| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产伦精品一区二区三区四那| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧美成人精品一区二区| 麻豆成人av视频| 国产欧美亚洲国产| 免费av不卡在线播放| 最近中文字幕2019免费版| 永久网站在线| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲精品亚洲一区二区| 黄片无遮挡物在线观看| 国产 一区精品| 男女下面进入的视频免费午夜| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 成人国产av品久久久| 欧美国产精品一级二级三级 | 3wmmmm亚洲av在线观看| www.色视频.com| 最近最新中文字幕免费大全7| 一本色道久久久久久精品综合| 日韩三级伦理在线观看| 精品久久久久久久久av| 亚洲国产精品一区三区| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 久热久热在线精品观看| av线在线观看网站| 亚洲图色成人| 夜夜爽夜夜爽视频| 日韩一区二区视频免费看| 午夜视频国产福利| 欧美日本视频| 国产成人freesex在线| 国产精品.久久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看| av网站免费在线观看视频| 精品人妻视频免费看| 多毛熟女@视频| 日本一二三区视频观看| 久久99热6这里只有精品| av在线app专区| 欧美+日韩+精品| 国产高潮美女av| 日本色播在线视频| 亚洲内射少妇av| 天天躁日日操中文字幕| 热re99久久精品国产66热6| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产午夜精品一二区理论片| 黄色一级大片看看| 中文字幕av成人在线电影| 久久久成人免费电影| 舔av片在线| 美女内射精品一级片tv| 成人二区视频| 男人添女人高潮全过程视频| 国产精品99久久久久久久久| 两个人的视频大全免费| 在线观看一区二区三区| 国产亚洲最大av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 七月丁香在线播放| 高清av免费在线| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产亚洲精品久久久com| 三级国产精品片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲,欧美,日韩| 国产av精品麻豆| 人妻夜夜爽99麻豆av| 中文欧美无线码| 美女国产视频在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| av女优亚洲男人天堂| 欧美 日韩 精品 国产| 欧美日本视频| 精品熟女少妇av免费看| 精品少妇久久久久久888优播| 天天躁日日操中文字幕| 三级国产精品片| 久久婷婷青草| 国产有黄有色有爽视频| 日韩中字成人| 在线观看国产h片| 99热6这里只有精品| 亚洲不卡免费看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产黄片美女视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日本vs欧美在线观看视频 | 久久久久视频综合| 偷拍熟女少妇极品色| 99久久精品国产国产毛片| 免费看av在线观看网站| 99热这里只有是精品50| 久久鲁丝午夜福利片| 高清黄色对白视频在线免费看 | 日韩av不卡免费在线播放| 一级毛片 在线播放| 久久97久久精品| 在线 av 中文字幕| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美丝袜亚洲另类| 精品人妻熟女av久视频| 欧美97在线视频| av在线蜜桃| 亚洲精品色激情综合| 91精品国产国语对白视频| 国产精品久久久久久精品古装| 国产色爽女视频免费观看| 伦理电影大哥的女人| 精品人妻偷拍中文字幕| 啦啦啦在线观看免费高清www| 美女cb高潮喷水在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲精品国产成人久久av| 日本欧美国产在线视频| 国产久久久一区二区三区| 国产在线免费精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 国国产精品蜜臀av免费| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 伦理电影大哥的女人| 国产精品一区二区性色av| www.色视频.com| 一区二区三区四区激情视频| 人妻系列 视频| 日韩视频在线欧美| 九九在线视频观看精品| 日韩中字成人| 99九九线精品视频在线观看视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 老熟女久久久| 欧美日韩综合久久久久久| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产精品一区二区在线不卡| 熟女人妻精品中文字幕| 观看免费一级毛片| 久久国产精品大桥未久av | 黄色配什么色好看| 在线观看av片永久免费下载| 黑人猛操日本美女一级片| 婷婷色综合www| 久久久久久久亚洲中文字幕| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久人人爽人人爽人人片va| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产色婷婷99| 99热这里只有是精品50| av专区在线播放| 内射极品少妇av片p| 男人舔奶头视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 韩国高清视频一区二区三区| 18+在线观看网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 七月丁香在线播放| 欧美成人一区二区免费高清观看| av黄色大香蕉| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 一本色道久久久久久精品综合| 日本一二三区视频观看| 精品视频人人做人人爽| 十八禁网站网址无遮挡 | 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产亚洲5aaaaa淫片| 九色成人免费人妻av| 国产片特级美女逼逼视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 少妇高潮的动态图| 99久久精品热视频| 亚洲国产最新在线播放| 日韩视频在线欧美| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 91久久精品国产一区二区三区| 免费在线观看成人毛片| 99re6热这里在线精品视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 各种免费的搞黄视频| 男男h啪啪无遮挡| 久久久久久久亚洲中文字幕| 在线观看av片永久免费下载| 一本色道久久久久久精品综合| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 精品亚洲成a人片在线观看 | 91久久精品国产一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线| 国产免费又黄又爽又色| 日本黄大片高清| 少妇的逼好多水| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩电影二区| 国产爱豆传媒在线观看| 97在线视频观看| 韩国av在线不卡| 看免费成人av毛片| 最近最新中文字幕免费大全7| 男人爽女人下面视频在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日产精品乱码卡一卡2卡三| av在线播放精品| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产免费福利视频在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一级av片app| 国产精品.久久久| av又黄又爽大尺度在线免费看| 黄色视频在线播放观看不卡| 中文资源天堂在线| 婷婷色综合大香蕉| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 深夜a级毛片| 99久久综合免费| 男人添女人高潮全过程视频| 日本av免费视频播放| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 免费人成在线观看视频色| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产免费视频播放在线视频| 在线观看一区二区三区激情| 久久久午夜欧美精品| 欧美zozozo另类| 欧美成人午夜免费资源| 女人久久www免费人成看片| 少妇人妻久久综合中文| 国产精品熟女久久久久浪| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产精品无大码| 欧美成人一区二区免费高清观看| 99热这里只有是精品50| 中文字幕av成人在线电影| 国产综合精华液| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产精品精品国产色婷婷| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日本免费在线观看一区| 精品久久久久久久久av| a级毛色黄片| 九草在线视频观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 国产亚洲精品久久久com| 久久亚洲国产成人精品v| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 黄色视频在线播放观看不卡| 女人久久www免费人成看片| 美女国产视频在线观看| 毛片女人毛片| 国产午夜精品一二区理论片| 久久国产乱子免费精品| 国产在视频线精品| 亚洲性久久影院| 日韩三级伦理在线观看| 久久99热6这里只有精品| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品免费大片| 干丝袜人妻中文字幕| 全区人妻精品视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产亚洲最大av| 亚洲av在线观看美女高潮| 日韩一本色道免费dvd| 成人无遮挡网站| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久99蜜桃精品久久| 久久午夜福利片| 国产av一区二区精品久久 | 大码成人一级视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 老女人水多毛片| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲色图综合在线观看| 一个人免费看片子| 少妇人妻一区二区三区视频| 丝袜脚勾引网站| 看免费成人av毛片| 在线观看三级黄色| 成人二区视频| 国产免费一级a男人的天堂| 91久久精品国产一区二区成人| 国产伦理片在线播放av一区| 色吧在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲经典国产精华液单| 嫩草影院新地址| 在线观看免费视频网站a站| 日韩精品有码人妻一区| 国产美女午夜福利| 99精国产麻豆久久婷婷| 天美传媒精品一区二区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 草草在线视频免费看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美三级亚洲精品| 日韩成人av中文字幕在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 日本wwww免费看| 热re99久久精品国产66热6| 永久免费av网站大全| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲,欧美,日韩| 国产男人的电影天堂91| 香蕉精品网在线| 国产高潮美女av| 好男人视频免费观看在线| 欧美高清成人免费视频www| 一级毛片 在线播放| 性色av一级| 国产免费一级a男人的天堂| videossex国产| 免费看光身美女| 舔av片在线| 精品视频人人做人人爽| 日本vs欧美在线观看视频 | 99久久综合免费| 色5月婷婷丁香| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲国产色片| av天堂中文字幕网| 久久精品久久精品一区二区三区| 秋霞伦理黄片| 色哟哟·www| 亚洲人成网站在线观看播放| 多毛熟女@视频| 久久久欧美国产精品| 有码 亚洲区| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲av成人精品一二三区| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品视频女| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 少妇的逼水好多| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美3d第一页| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 热99国产精品久久久久久7| 岛国毛片在线播放| 亚洲国产精品一区三区| 人妻 亚洲 视频| 日韩三级伦理在线观看| av在线app专区| 国产一区二区在线观看日韩| 久久久久性生活片| 两个人的视频大全免费| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日韩国内少妇激情av| 国产亚洲最大av| 美女中出高潮动态图| 97超视频在线观看视频| 中文在线观看免费www的网站| 国内揄拍国产精品人妻在线| 嘟嘟电影网在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 国产精品熟女久久久久浪| 久久久久久久久久人人人人人人| 男男h啪啪无遮挡| 日本黄色日本黄色录像| 欧美一区二区亚洲| 国产精品不卡视频一区二区| 精品久久久久久久久av| 夜夜爽夜夜爽视频| 一级片'在线观看视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久精品国产a三级三级三级| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲精品成人av观看孕妇| 边亲边吃奶的免费视频| 国产精品久久久久成人av| 插逼视频在线观看| 午夜福利视频精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 高清日韩中文字幕在线| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 99久久人妻综合| 日韩中文字幕视频在线看片 | 免费人妻精品一区二区三区视频| 日韩一区二区三区影片| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 最近的中文字幕免费完整| 午夜福利高清视频| 一本一本综合久久| 久久热精品热| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲av欧美aⅴ国产| av女优亚洲男人天堂| 中文字幕av成人在线电影| 女性被躁到高潮视频| 我的老师免费观看完整版| 久久久久精品性色| 国产高潮美女av| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产| 蜜臀久久99精品久久宅男| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 成人黄色视频免费在线看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日韩欧美一区视频在线观看 | 日本与韩国留学比较| 久久精品久久久久久久性| 街头女战士在线观看网站| 免费看av在线观看网站| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美日韩亚洲高清精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 午夜精品国产一区二区电影| 久久久久精品久久久久真实原创| 99热这里只有精品一区| 七月丁香在线播放|