苦瓜提取物對(duì)糖尿病大鼠早期腎損傷的保護(hù)作用

翟玉榮 劉 波(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)藥理教研室，廣東 珠海 5904)

苦瓜提取物對(duì)糖尿病大鼠早期腎損傷的保護(hù)作用

翟玉榮 劉 波1(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)藥理教研室，廣東 珠海 519041)

目的 探討苦瓜提取物(MCE)對(duì)糖尿病(DM)大鼠早期腎損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法 鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)產(chǎn)生大鼠DM模型，隨機(jī)將大鼠分為正常組(NC)、模型組(DN)、MCE預(yù)防給藥低、高劑量組(A、B組)、MCE治療給藥低、高劑量組(C、D組)。檢測各組大鼠腎臟肥大指數(shù)、血糖、測定24 h尿蛋白量、24 h尿微量白蛋白排泄量(UAE)量及尿中β2-球蛋白(β2-MG)濃度及腎皮質(zhì)丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察腎臟病理學(xué)變化。結(jié)果 A、B、C、D各組均能明顯降低DN組大鼠的血糖、腎指數(shù)及24 h尿蛋白量、24 h UAE量、尿β2-MG濃度，并顯著降低腎皮質(zhì)MDA含量和明顯升高SOD活性(P＜0.05或P＜0.01)，且MCE各給藥組均在不同程度上減輕了DN組大鼠的腎小球結(jié)構(gòu)模糊、細(xì)胞數(shù)增多等病理變化;同劑量下，A組較C組，B組較D組效應(yīng)更顯著(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論 苦瓜提取物對(duì)DM的早期腎損傷有一定保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

苦瓜提取物;糖尿病腎病

糖尿病腎病(DN)是2型糖尿病(DM)最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一〔1〕，目前尚無特效藥物治療。具有輔助降血糖、降血脂、抗氧化、增強(qiáng)免疫力及預(yù)防肥胖等保健功能〔2〕。有文獻(xiàn)〔3〕表明苦瓜皂苷對(duì) DN有一定保護(hù)作用，但苦瓜提取物(MCE)對(duì)DN早期腎損傷的保護(hù)作用還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以鏈脲佐菌(STZ)誘導(dǎo)2型DM大鼠腎損傷模型，重點(diǎn)觀察苦瓜提取物不同給藥方案療效有何差異，并觀察其對(duì)腎皮質(zhì)中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響，初步探討苦瓜提取物對(duì)DN的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選用健康雄性清潔級(jí)SD大鼠60只，體重200～250 g(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，合格證號(hào)scxk(粵)2011-0002。

1.2 藥品與試劑 MCE(購于福州日冕科技開發(fā)有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào):Q/RM0513-KG-2011，甙與苦瓜苷1%)。STZ(美國Sigma公司生產(chǎn))?？捡R斯亮藍(lán)蛋白、尿蛋白、微量白蛋白(UAE)、β2微球蛋白(β2-MG)的測試盒均購于南京建成生物公司;One Touch自動(dòng)血糖分析儀及配套試紙(美國強(qiáng)生公司)，SN-6930A型液閃儀與sN-6100型γ計(jì)數(shù)器(上海核所日環(huán)光電公司)。

1.3 DM模型制備與分組 60只大鼠按體重隨機(jī)分為正常組(NC)、模型組(DN)、MCE預(yù)防給藥低、高劑量組(A組、B組)、MCE治療給藥低、高劑量組(C組、D組)。每組10只。各組大鼠自由進(jìn)食、飲水。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，禁食12 h，除正常組外，其余各組大鼠用 0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH4.2，4℃)臨用前配成1%STZ溶液，按60 mg/kg給予腹腔注射，72 h后分別取上述各組大鼠尾尖血測血糖，1次/d，連續(xù)3 d，以空腹血糖≥16.7 mmol/L者，視為DM大鼠模型已制成。NC組給予同等容量的枸櫞酸溶液腹腔注射。各組均給予普通飼料，自由飲水。

1.4 給藥方法 A組、B組于造模前2 w開始給藥，分別按100 mg/kg及300 mg/kg劑量每日灌服苦瓜提取物，1次/d;C組、D組于成模后第3天開始給藥，給藥劑量及方法同治療組;NC和DN組造模后第3天，每日灌服與給藥組相同體積的蒸餾水，各組均連續(xù)給藥至成模后4 w末。

1.5 一般項(xiàng)目觀察 包括大鼠的精神狀態(tài)、毛色、飲食量、尿量、體重等。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物后，稱量左側(cè)腎重，計(jì)算腎臟肥大指數(shù)。腎肥大指數(shù) =(左腎重/體重)×100%。

1.6 尿、血生化指標(biāo)測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前收集24 h尿液，以放射免疫法測定24 h尿蛋白量、24 h UAE及β2-MG濃度，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。腹主動(dòng)脈取血，采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖。

1.7 腎皮質(zhì)MDA含量、SOD活性測定 取0.3 g腎皮質(zhì)置于玻璃皿中，加入9倍體積的冷生理鹽水，在冰浴條件下剪碎并制成勻漿，取濃度為100 g/L的組織勻漿以4 000 r/min離心15 min，留上清液待測。采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA含量(nmol/mgprot)、黃嘌呤氧化酶法測定 SOD活性(U/mgprot)，測定具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 腎臟病理變化觀察 取左腎“去包膜”置于40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm切片行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察病理變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 NC組大鼠活躍，毛色光滑，精神狀況良好，反應(yīng)靈敏，體重增長較快;DN組大鼠出現(xiàn)多飲多食多尿，明顯消瘦，精神萎靡，毛色晦暗，行動(dòng)遲緩，體重減輕或增長緩慢;A組和B組精神狀況良好，體重減輕，反應(yīng)靈敏度較正常組稍差;C組和D組精神狀況，體重變化及反應(yīng)靈敏度與A、B組情況相近，但較NC組稍差。

2.2 MCE對(duì)DM大鼠血糖、腎指數(shù)及尿中蛋白的影響 DN組與NC組相比，空腹血糖、腎指數(shù)及24 h尿蛋白、U-MA量及尿β2-MG 濃度均明顯升高(P＜0.01);與 DN 組相比，A、B、C、D 各組空腹血糖、腎指數(shù)及24 h尿蛋白、UAE量及尿β2-MG濃度均顯著下降(P＜0.05或P＜0.01);同劑量下組間比較，A組與C組、B組與D組之間比較血糖下降均無明顯差異(P＞0.05)，B組較D組腎指數(shù)減小更為明顯，差異顯著(P＜0.05)，A組較C組腎指數(shù)下降稍明顯，但差異不顯著(P＞0.05)，24 h尿蛋白、UAE量及尿β2-MG濃度，A組較C組、B組較D組下降更為明顯(P＜0.05或 P＜0.01)，見表 1。

2.3 MCE對(duì)腎組織病理形態(tài)改變的影響 NC組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清楚，大小較一致，腎小球血管袢薄而清晰，無系膜增生，腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)沒有明顯增加，其周腎小管基本正常;DN組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)模糊，呈分葉狀，系膜細(xì)胞增生，腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯增加。MCE各給藥組較DN組相比，上述改變有所減輕，周圍腎小管結(jié)構(gòu)相對(duì)正常，且A組比C組，B組比D組病理變化減輕較為顯著，見圖1。

2.4 MCE對(duì)DM大鼠腎皮質(zhì)MDA、SOD的影響 與NC組相比，DN組腎皮質(zhì)MDA含量明顯升高、SOD活性明顯下降(P＜0.01);與模型組相比，A、B、C、D各組MDA含量顯著降低、SOD活性顯著升高(P＜0.05或P＜0.01);同劑量下，A組較C組、B組較D組的SOD活性升高程度更為明顯，兩組間比較差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)，而MDA含量變化A組較C組、B組較D組兩組間比較無顯著差異(P＞0.05)，見表2。

表1 MCE對(duì)DM大鼠血糖、腎指數(shù)及尿中蛋白的影響(±s，n=10)

表1 MCE對(duì)DM大鼠血糖、腎指數(shù)及尿中蛋白的影響(±s，n=10)

與 NC 組比較:1)P＜0.01;與 DN 組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01;與 C 組比較:4)P＜0.05，5)P＜0.01;與 D 組比較:6)P＜0.05，7)P＜0.01;下表同

組別 劑量(mg/kg) 空腹血糖(mmol/L) 腎指數(shù)(mg/g) 尿蛋白(mg/24 h) UAE(mg/24 h) β2-MG(mg/L)2±0.03 DN 組 － 19.95±0.571) 4.85±0.591) 53.2±3.41) 4.25±0.311) 0.35±0.051)A 組 100 17.12±0.833) 3.89±0.683) 24.3±2.73)4) 1.73±0.463)5) 0.22±0.033)B 組 300 15.96±1.173) 3.58±0.483)4) 20.1±1.33)6) 1.15±0.233)7) 0.16±0.033)6)C 組 100 17.58±1.652) 4.13±0.323) 29.8±2.63) 3.62±0.682) 0.21±0.033)D 組 300 16.20±1.083) 4.08±0.792) 27.2±1.83) 2.42±0.343) 0.20±0.023)NC 組 － 5.65±0.41 3.13±0.62 14.6±1.2 0.91±0.36 0.2

圖1 各組大鼠DM早期腎臟病理形態(tài)學(xué)變化(HE，×400)

表2MCE對(duì)糖尿病大鼠腎皮質(zhì)MDA、SOD的影響(±s，n=10)

表2MCE對(duì)糖尿病大鼠腎皮質(zhì)MDA、SOD的影響(±s，n=10)

組別 劑量(mg/kg)MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)NC組-2.65±0.41 320.44±40.60 DN 組 - 7.16±0.571) 187.06±27.721)A 組 100 5.62±0.833) 235.63±42.492)4)B 組 300 5.01±1.173) 241.08±61.893)6)C 組 100 5.76±1.653) 219.94±32.402)D 組 300 5.56±1.083) 226.06±35.822)

3 討論DN

病變主要累及腎小球，亦可累及腎小管，而蛋白尿是DN最重要的臨床特征，與DN的嚴(yán)重程度及病情進(jìn)展密切相關(guān)。腎小球病變時(shí)尿蛋白主要以中高分子質(zhì)量蛋白為主，腎小管病變時(shí)尿蛋白主要以微量白蛋白、β2-MG等小分子質(zhì)量蛋白為主〔4〕，因此，檢測尿中不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)成分及其水平變化可間接反映DN病人腎損傷的部位和程度，是腎早期損傷的敏感指標(biāo)，也是治療效果的直接判斷指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，MCE對(duì)DN的早期腎損傷有一定的保護(hù)作用，療效上，預(yù)防給藥組要優(yōu)于治療給藥組。

DN機(jī)制尚未完全闡明，氧化應(yīng)激是其發(fā)生發(fā)展的共同機(jī)制〔5〕。DM時(shí)腎組織糖代謝紊亂，葡萄糖通過自身氧化、氧化磷酸化、非酶糖基化等途徑產(chǎn)生過多活性氧，而腎組織抗氧化物質(zhì)如SOD等顯著減少，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA及其降解產(chǎn)物含量增高〔6〕。過量的活性氧對(duì)腎小球內(nèi)皮、上皮及系膜細(xì)胞的直接損傷和趨化作用，吸引中性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞在血管周圍浸潤，從而改變腎小球毛細(xì)血管和基底膜的通透性及血流動(dòng)力學(xué)，造成大量持續(xù)性蛋白尿〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示MCE DN早期腎損傷的腎保護(hù)作用可能與其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

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R285;R97

A

1005-9202(2015)09-2358-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.021

貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(No.gzwk2009-1-067)

1 生理教研室

劉 波(1978-)，男，碩士，講師，主要從事腎臟生理研究。

翟玉榮(1976-)，女，碩士，副教授，主要從事心血管藥理及新藥研發(fā)研究。

〔2014-12-20修回〕

(編輯 李相軍/滕欣航)