Kruppel樣因子4在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及KLF4基因啟動子區(qū)的生物信息學(xué)分析

楊 菁 周 力 許 鐘 (貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 貴陽 550002)

Kruppel樣因子4在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及KLF4基因啟動子區(qū)的生物信息學(xué)分析

楊 菁 周 力 許 鐘 (貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 貴陽 550002)

目的 檢測Kruppel樣因子KLF4基因在人胃癌細(xì)胞株MKN－45及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES－1的表達(dá)情況，并應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析KLF4基因啟動子區(qū)序列，預(yù)測胃癌發(fā)生中其涉及的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。方法 采用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測MKN－45及GES－1中KLF4 mRNA的表達(dá);利用多種在線軟件獲取并分析人KLF4基因啟動子序列，預(yù)測其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和胃癌組織中相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果 實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果顯示:KLF4 mRNA在人胃癌細(xì)胞株MKN－45中的表達(dá)低于在人正常胃黏膜細(xì)胞株GES－1中的表達(dá)(4.24±0.15 vs 6.66±0.23)(P＜0.01);KLF4基因啟動子序列全長為4 915 bp，共涉及183個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，在胃癌中異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子有17個，包括AP－1、AP－2、HIF－1、SP3等。結(jié)論 KLF4 mRNA在胃癌細(xì)胞株MKN－45中表達(dá)下調(diào)，生物信息學(xué)分析提示在胃癌發(fā)生中AP－1、AP－2、HIF－1、SP3轉(zhuǎn)錄因子等可能參與調(diào)控KLF4的表達(dá)。

Kruppel樣因子4;胃腫瘤;啟動子;生物信息學(xué)

Kruppel樣因子(KLF)4是真核生物中含有3個鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在消化道組織細(xì)胞中幾乎均可檢測到其表達(dá)〔1〕，故又稱其為胃腸富集型KLF。然而，KLF4在各消化道組織細(xì)胞中的表達(dá)程度不盡相同，且在不同的消化道組織細(xì)胞中可與不同的生物因子相互作用，因此會產(chǎn)生促癌或者抑癌的不同效應(yīng)。大量研究表明KLF4低表達(dá)于胃癌組織細(xì)胞中〔2～4〕，由此可證明其在胃腸道腫瘤中主要起抑癌作用。但是，KLF4自身的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制至今尚未完全闡明。我們設(shè)想，能否通過基因工程方法使正常胃黏膜細(xì)胞或胃癌細(xì)胞內(nèi)KLF4的表達(dá)維持在較高水平，從而延緩甚至是逆轉(zhuǎn)胃癌的發(fā)生發(fā)展?；谝陨显O(shè)想，本研究通過實(shí)時熒光定量PCR檢測KLF4在胃癌細(xì)胞株MKN－45及正常胃黏膜細(xì)胞GES－1中的表達(dá)情況，并利用生物學(xué)信息技術(shù)對人KLF4基因序列、啟動子區(qū)進(jìn)行分析，獲得該基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步篩選出胃癌中KLF4基因可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，以期采用人工干預(yù)手段使KLF4基因在胃腸道正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，為后續(xù)研究提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為胃腸道腫瘤的預(yù)防和治療尋求新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料、細(xì)胞株和試劑 人胃癌細(xì)胞株SGC－7901、MKN－45和人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株 GES－1購自 ATCC細(xì)胞庫;HDMEM和RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自BBI公司;青－鏈霉素雙抗購自美國Hyclone公司;組織細(xì)胞總RNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Therom公司;SYBR－Green－Kit購自大連TAKARA公司。人KLF4基因序列從美國國家生物技術(shù)信息中心在線核苷酸數(shù)據(jù)庫(Gen Bank)獲得。在線轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件包含 Patch、P－Match、MatrixCatch、AliBaba2等;在線基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫Gene Expression Atlas。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時熒光定量PCR檢測KLF4 mRNA的表達(dá) 參照組織細(xì)胞總RNA提取試劑盒說明書，嚴(yán)格操作后分別提取兩種細(xì)胞的總RNA。以總RNA中的mRNA為模板，參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測KLF4 mRNA的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參照，分析產(chǎn)物相對表達(dá)量。KLF4上游引物為ATGGGCAAGTTCGTGCTGAAGGC，下 游 引 物 為 GCATCTGATCGGGCAGGAAGGAT;GAPDH上游引物為ACAACTTTGGTATCGTGGAAGGAC，下游引物為 AAAGGTGGAGGAGTGGGTGTCG;采用2－△Ct方法分析目的基因表達(dá)的相對倍數(shù)，△Ct=目的基因Ct值－內(nèi)參基因Ct值。

1.2.2 KLF4啟動子區(qū)序列的獲得 基于KLF4的基因序列ID，應(yīng)用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的鏈接獲取啟動子序列。

1.2.3 KLF4啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析 通過在線啟動子 區(qū) 域 預(yù) 測 分 析 軟 件 PromotorScan(http://www－bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)分析啟動子序列，通過轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫TRANSFAC中的在線轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件包括Patch、P－Match、AliBaba2(http://www.gene－regulation.com/pub/programs.html)預(yù)測KLF4啟動子序列順式作用元件，分析其可能轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.4 胃癌組織中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選 應(yīng)用在線基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫Gene Expression Atlas(http://www.ebi.ac.uk/gxa/home)篩查胃癌組織中異常表達(dá)的蛋白，與預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行對比，獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 KLF4 mRNA在胃癌細(xì)胞系及胃黏膜上皮細(xì)胞系中的表達(dá) 實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，人胃癌細(xì)胞株MKN－45和人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES－1中KLF4 mRNA表達(dá)量相對比，前者低于后者(6.66±0.23 vs 4.24±0.15，P＜0.01)。

2.2 人KLF4基因基本信息及啟動子序列 人KLF4基因ID:9314，定位于9號染色體負(fù)鏈(9q31)，全長4 915 bp，其mRNA ID:NM_004235.4。該基因啟動子 ID:HPRM23684，全長1 319 bp，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)－785 bp至 +534 bp之間。

2.3 人KLF4基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果 應(yīng)用PromotorScan分析啟動子序列結(jié)果顯示共57個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，涉及17個轉(zhuǎn)錄因子，其中Sp1結(jié)合位點(diǎn)共22個、GCF共6個、AP－2共8個、UCE.2共4個、T－Ag共 3個。應(yīng)用 Patch在線軟件分析，參數(shù)設(shè)置 set of sites選擇“vertebrates”，Lower score boundary設(shè)為“90”，其他采用默認(rèn)設(shè)置，預(yù)測結(jié)果共1 425個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，手工篩查物種為人的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)共562個，經(jīng)匯總?cè)ブ?，共涉?13個轉(zhuǎn)錄因子。應(yīng)用P－Match在線軟件分析，當(dāng)Cut－offs使用參數(shù)為“to minimize the sum of both error rates”時，預(yù)測到18個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(圖1)，去除重復(fù)共涉及9個轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)使用參數(shù)為“to minimize false negative matches”，共預(yù)測到295個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)匯總?cè)ブ?，共涉?5個轉(zhuǎn)錄因子，應(yīng)用AliBaba2在線軟件分析，取在線軟件默認(rèn)設(shè)置參數(shù)，預(yù)測結(jié)果共172個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)匯總?cè)ブ?，共涉?2個轉(zhuǎn)錄因子。匯總以上軟件預(yù)測結(jié)果并去除重復(fù)，結(jié)果共涉及 183 個轉(zhuǎn)錄因子:1－Oct、alpha－CBF、AP、AP－1、AP－2、AP－2alph、AP－2alphaA、AP－2alphaB、AP－4、APRT－mouse_US、AREB6、ARP－1、ATF、BRF1、BSAP、C/EBPal、C/EBPalp、CAC－binding、protein、CACCC－bi、CACCC－binding、factor、CAR、CBAF、CBF－B、CBTF、CDP CR3、CDP2、c－Ets－1、c－Ets－2、CF1、c－Fos、c－J、c－Jun、Clox、c－Myb、c－Myc、CP1、CP1A、CP2、CPE_bind、CRE、CREB、CRE－BP1、c－Rel、CTCF、CTF、CUTL1、E1、E2、E2F+p107、E47、EARLY－SEQ1、EGR－1、Elk－1、ER、ER－alpha、ETF、Evi－1、EZF－2、FOR1、FOR2、Fra－1、FXR、gammaCAAT、gammaCAC1、gammaCAC2、GATA－1、GCF、GCN4、GGCGG、GLI3、GLO、GR、GTCAC、H1TF2、H4TF1、H4TF－2、HFH－1、HIF－1、HiNFD、HiNF－M、HiNF－P、HNF－1A、HNF－1B、HNF－1C、HNF－3alpha、HNF－3B、Hp55、Hp65、ISGF－3、JCV_repeated_sequenc、Krox－20、KROX24、LEF－1、LF－A1、LUN－1、LXR－alpha、LXR－beta、MAF、MafG、Max、Max1、MAZ、MEB－1、MIG1、MLTF、MTF－1、MT－I.6、MyoD、myogenin/NF－1、MZF－1、NF－1、NF－1/L、NFAT－1、NF－ATp、NF－E、NF－E2、NF－E3、NF－kappaB、NF－muE1、NF－S、NIP、Nkx2－5、NRF－2Oct－1A、p58、Pax－2、Pax－5、Pax－8、PEA3、PEBP2alphaA1、POU1F1a、PPUR、PuF、PXR－1、R、RAP1、RAR－alph、RAR－alpha1、RAR－beta、RAR－beta2、RAR－gamma、REB1、Ref－1、represso、RFX2、RREB－1、RSRFC4、RXR－alpha、RXR－beta、RXR－gamma、SDR_RS、SMAD－3、SMAD－4、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、SRF、STATx、SXR、T3R、T3R－alpha、T3R－beta1、T3R－beta2、T－Ag、Tax/CREB、TBP、TEC1、TFIID、TMF、TR2－11、UCE.2、USF、USF1、USF2、VDR、v－ErbA、v－Jun、WT1、XBP－1、XFD－2、YY1、ZID。

圖1 P-Match分析KLF4啟動子區(qū)順式作用元件

2.4 篩查胃癌中人KLF4啟動子區(qū)可能轉(zhuǎn)錄因子 應(yīng)用在線基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫Gene Expression Atlas檢索胃癌中異常表達(dá)的蛋白結(jié)果共3 249個，與上述預(yù)測的183個轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行對比，取交集獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子中共有17個在胃癌中異常表達(dá):AP－1、AP－2、AP－4、ATF、CTCF、FXR、HIF－1、LEF－1、NF－1、Pax－5、Pax－8、RREB－1、SMAD－4、SP3、SRF、USF1、YY1。

3 討論

伴隨著人類基因組計(jì)劃(HGP)的成功，特別是進(jìn)入到后基因組計(jì)劃(Post－HGP)時代，對基因的功能研究已成為熱點(diǎn)之一。本課題所研究的KLF4基因是真核生物中的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，屬于鋅指蛋白Kruppel家族，位于9q31染色體，含有5個外顯子，其cDNA編碼含470個氨基酸的蛋白，其開放讀碼框包括轉(zhuǎn)錄激活域、轉(zhuǎn)錄抑制域、鋅指DNA結(jié)合域、核定位信號和潛在PEST序列〔5〕。KLF4基因在細(xì)胞增殖、分化、遷移、炎癥中具有調(diào)控作用。除此之外，KLF4基因作為胃腸富集型KLF，與消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本課題選擇MKN－45和GES－1兩種消化道組織細(xì)胞作為研究載體，通過對比檢測兩種細(xì)胞中KLF4基因表達(dá)情況，提示KLF4基因的表達(dá)水平與組織的癌性呈負(fù)相關(guān)趨勢。Jiang等〔6〕應(yīng)用免疫組織化學(xué)法分析不同分期的胃癌組織后顯示，KLF4蛋白高表達(dá)于正常胃組織和癌旁組織，低表達(dá)于胃上皮瘤變組織，而在胃腫瘤組織中幾乎無表達(dá)，且隨著胃癌分期的遞增，KLF4的表達(dá)逐漸減弱。亦有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)研究表明KLF4表達(dá)率與腫瘤臨床分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等存在顯著地負(fù)相關(guān)特性〔7，8〕。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高表達(dá)KLF4基因的胃癌患者與低表達(dá)KLF4基因的胃癌患者相比，前者明顯表現(xiàn)出更高的總生存率〔9〕，以上現(xiàn)象說明 KLF4的高表達(dá)可產(chǎn)生一定的抑癌作用。

本研究發(fā)現(xiàn)人胃癌細(xì)胞株MKN－45的KLF4 mRNA表達(dá)明顯低于人正常胃黏膜細(xì)胞GES－1中KLF4 mRNA的表達(dá)，這一點(diǎn)印證了KLF4基因在癌性組織中低表達(dá)這一現(xiàn)象。與此同時，胃正常組織與癌變組織中的KLF4定量檢測增添了數(shù)據(jù)支持;另一方面，也為本課題后續(xù)的關(guān)于KLF4基因啟動子區(qū)調(diào)控干預(yù)實(shí)驗(yàn)提供相應(yīng)的研究支持，乃至于為今后以期利用MKN－45作為研究對象的研究人員提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。但是由于本課題僅選用一種胃癌細(xì)胞(MKN－45)與正常人胃黏膜細(xì)胞(GES－1)做對比，結(jié)果具有一定局限性，是否存在其他更為典型、更為有意義的參照細(xì)胞，相信隨著研究深入會被發(fā)現(xiàn)與認(rèn)知。

目前，生物信息學(xué)分析方法被廣泛應(yīng)用于基因的轉(zhuǎn)錄、調(diào)控等方向研究。應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測KLF4基因可能的調(diào)控元件，具有高效、經(jīng)濟(jì)的等優(yōu)點(diǎn)，對進(jìn)一步闡釋該基因的功能等研究工作具有重要作用。本研究中我們預(yù)測了KFL4基因啟動子區(qū)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子共183個，人胃癌KLF4基因啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子17個。這就為擬在KLF4啟動子區(qū)作出相關(guān)研究的人員提供一個較明確的方向，從而可以利用該生物信息學(xué)分析所得出的結(jié)果，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等研究工作，起到事半功倍的效果。國外相關(guān)研究報道，在KLF4基因5′側(cè)翼區(qū)核苷酸序列中存在AP－1的結(jié)合位點(diǎn)，且KLF4基因受轉(zhuǎn)錄因子 AP－2、SP3 調(diào)控〔10，11〕;在缺氧情況下，KLF4 的表達(dá)下調(diào)表達(dá)受 HIF－1α依賴方式調(diào)控〔12〕。這些數(shù)據(jù)均為我們的預(yù)測提供了支持證據(jù)，對進(jìn)一步的研究提供了理論基礎(chǔ)。與此同時，相信我們的研究成果亦可為廣大從事KLF4基因研究的相關(guān)人員提供理論及數(shù)據(jù)上的參考。雖然關(guān)于KLF4基因啟動子區(qū)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測與實(shí)際情況可能會出現(xiàn)一定的偏差，進(jìn)一步的驗(yàn)證過程不僅需要生物信息數(shù)據(jù)庫進(jìn)行持續(xù)的更新與改進(jìn)，也需要廣大的研究人員不斷提供相應(yīng)的研究成果來一一佐證。我們應(yīng)充分重視生物信息學(xué)分析方法的作用，利用該方法盡可能地挖掘國內(nèi)外已有研究成果，從而有效縮小研究范圍，有助于進(jìn)一步研究在胃癌發(fā)生過程中抑癌基因KLF4的轉(zhuǎn)錄、調(diào)控等作用機(jī)制，為腫瘤的預(yù)測、預(yù)防及靶向治療提供探索方向和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，本文再次證實(shí)KLF4與胃癌的負(fù)相關(guān)，同時為下一步的深入研究奠定了基礎(chǔ)。通過運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法預(yù)測KLF4基因的啟動子區(qū)相關(guān)調(diào)控因子，利用該分析結(jié)果指導(dǎo)對KLF4基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的探究，試圖在今后的研究中闡釋KLF4基因與消化道腫瘤疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系以及在其中的具體作用。著力于基因?qū)用婕胺肿铀綖橄滥[瘤疾病的預(yù)防與治療提供新的思路與方向。

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Expression of tumor suppressor gene KLF4 in gastric cancer cells and bioinformatics analysis on promoter region of KLF4

YANG Jing，ZHOU Li，XU Zhong.
Department of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Guiyang Medical College，Guiyang 550002，Guizhou，China

ObjectiveTo explore the expression of KLF4 gene in human gastric cancer cell lines MKN－45 and analyze the gene sequence of KLF4 promoter region in gastric cancer.Methods Real－time PCR was used to detect KLF4 mRNA expression in MKN－45 and GES－1.A variety of online software were used to analyze the sequences of KLF4 gene promoter and predict the binding sites of transcriptional factor and relevant transcription factors in gastric cancer.Results Real－time PCR showed that the KLF4 mRNA level in MKN－45 was significantly lower than that of GES－1(4.24±0.15 vs 6.66±0.23)with significant differences(P＜0.01).The promoter region of KLF4 gene was 4 915 bp long，containing 183 transcriptional factors.Among them，17 transcriptional factors were abnormally expressed in gastric cancer，including AP－1，AP－2，HIF－1，SP3，etc.Conclusions KLF4 mRNA expression is down－regulated in gastric cancer cell line MKN－45.Bioinformatics analysis shows that transcriptional factors AP－1，AP－2，HIF－1 and SP3 may be involved in regulation of KLF4 expression in the development of gastric cancer，which provides theoretical basis for further research.

Kruppel like factor(KLF)4;Gastric cancer;Promoter;Bioinformatics

R73

A

1005-9202(2015)09-2350-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.018

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(No.〔2012〕2240)

周 力(1956－)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事消化內(nèi)科相關(guān)疾病研究。

楊 菁(1986－)，女，碩士在讀，主要從事消化內(nèi)科相關(guān)疾病研究。

〔2013－12－09 修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢園)