神經(jīng)根回植聯(lián)合細(xì)胞移植治療大鼠臂叢神經(jīng)根性撕脫傷的作用

李曉濤 李長(zhǎng)德 解云川 孫國(guó)娟 (佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

神經(jīng)根回植聯(lián)合細(xì)胞移植治療大鼠臂叢神經(jīng)根性撕脫傷的作用

李曉濤 李長(zhǎng)德 解云川 孫國(guó)娟 (佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的 研究神經(jīng)根回植聯(lián)合細(xì)胞移植治療大鼠臂叢神經(jīng)根性撕脫傷的治療作用。方法 隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)大鼠分成3組:A組(頸神經(jīng)根撕脫組)、B組(頸神經(jīng)根撕脫后回植組)、C組〔頸神經(jīng)根撕脫后回植聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)與雪旺細(xì)胞(SCs)移植組〕;于術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)觀察實(shí)驗(yàn)大鼠患肢功能恢復(fù)情況及相應(yīng)脊髓損傷節(jié)段前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活率。結(jié)果 術(shù)后1～8 w，B、C組患肢活動(dòng)功能恢復(fù)情況較A組明顯改善;各組脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活率比較:A組＜B組＜C組，組間進(jìn)行兩兩比較有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)論 神經(jīng)根回植術(shù)聯(lián)合細(xì)胞移植能夠改善受傷大鼠的患肢功能，對(duì)損傷局部的神經(jīng)元提供支持、保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)作用，可以挽救局部瀕死的神經(jīng)元，減少損傷局部細(xì)胞的死亡。

神經(jīng)干細(xì)胞;雪旺細(xì)胞;移植;臂叢神經(jīng)

交通傷、高空墜落等高能量創(chuàng)傷較以往有大幅度增長(zhǎng)，上臂叢神經(jīng)根性撕脫傷患者上肢的功能將不同程度的喪失，以往臨床上多采取撕脫的神經(jīng)根回植或其他神經(jīng)移位等手術(shù)方法治療傷者，但療效一般。上世紀(jì)末，人們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)具有分化的潛能，這改變了之前的人們對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞不可再生的認(rèn)識(shí)，也給為人們利用NSCs的移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的思路。雪旺細(xì)胞(SCs)是周?chē)窠?jīng)的膠質(zhì)細(xì)胞，其功能活躍，能分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)周?chē)窠?jīng)的生長(zhǎng)、發(fā)育及功能的保持起到重要作用。當(dāng)周?chē)窠?jīng)損傷后，其對(duì)于神經(jīng)的再生與修復(fù)也起到至關(guān)重要的作用。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察NSCs與SCs共移植對(duì)臂叢神經(jīng)根性撕脫傷大鼠患肢功能的影響以及損傷局部神經(jīng)元的存活情況，綜合評(píng)價(jià)細(xì)胞移植的療效，進(jìn)而闡明細(xì)胞移植治療作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠60只，鼠齡(60±5)d，體重(250±20)g，健康清潔級(jí)，隨機(jī)分為3組，每組20只，A組(頸神經(jīng)根撕脫組)、B組(頸神經(jīng)根撕脫后回植組)、C組(頸神經(jīng)根撕脫后回植聯(lián)合NSCs與SCs移植組)。

1.2 主要試劑 DMEM/F12、B27(Gibco公司)，小鼠抗大鼠BrdU抗體、小鼠抗大鼠Nestin抗體、FITC標(biāo)記羊多克隆抗體(Sigma公司)，S-100抗體、鼠抗大鼠GFAP抗體、小鼠抗大鼠MAP-2抗體 、SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 A、B、C組均制備成臂叢神經(jīng)根性撕脫傷模型，手術(shù)方法參照朱清遠(yuǎn)等〔1〕的制備方法。方法如下:取頸椎后正中切口，依次切開(kāi)皮膚、皮下組織及深筋膜，以C2及C7棘突確定椎體及神經(jīng)根次序，沿中線向右側(cè)或左側(cè)分離棘突旁肌肉組織，手術(shù)顯微鏡下顯露硬脊膜和固定C5、C6、C7神經(jīng)根，將C5、C6、C7神經(jīng)根予以撕脫，操作應(yīng)輕柔，然后將C6神經(jīng)根殘端標(biāo)記后埋于棘突旁肌肉組織內(nèi)，再將撕脫的C5、C7神經(jīng)根剪除1.5～2.0 mm后分別予以曠置。大鼠模型制備后1 w，A組局部顯露后注入與移植細(xì)胞同體積的生理鹽水;B組行神經(jīng)根回植術(shù)并局部注入與移植細(xì)胞同體積的生理鹽水;C組行神經(jīng)根回植及細(xì)胞移植術(shù)。神經(jīng)根回植方法如下:沿原手術(shù)切口切開(kāi)皮膚、皮下組織及深筋膜，以C2及C7棘突確定椎體及神經(jīng)根次序，分離棘突旁組織，手術(shù)顯微鏡下將C6神經(jīng)根斷端修整后插入相應(yīng)節(jié)段頸髓硬脊膜下約0.8～1.0 mm深處，行神經(jīng)外膜縫合。C組還要在神經(jīng)根回植后行細(xì)胞移植。細(xì)胞移植方法如下:取微量注射器沿C6神經(jīng)根的回植部位刺入脊髓，深度約1.0～1.5 mm。A組和B組注入5 μl生理鹽水，C組移植入Brdu標(biāo)記后的5 μl NSCs和5 μl SCs。緩慢地將細(xì)胞懸液注入上述移植部位，注射速度為0.8～1.0 μl/min，細(xì)胞懸液中細(xì)胞密度約為1.0×106/μl。術(shù)后給予抗生素預(yù)防感染。于不同時(shí)間點(diǎn)觀察、記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物患肢功能恢復(fù)情況、利用HE染色法計(jì)算大鼠相應(yīng)脊髓損傷節(jié)段前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大體功能評(píng)價(jià) 術(shù)后1 w左右，可見(jiàn)少數(shù)大鼠開(kāi)始出現(xiàn)手術(shù)側(cè)肘關(guān)節(jié)的屈曲動(dòng)作，但大多數(shù)大鼠的活動(dòng)幅度小于30°;隨著恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠手術(shù)側(cè)肘關(guān)節(jié)的屈曲動(dòng)作有所恢復(fù)，至術(shù)后4～8 w時(shí)，B、C組手術(shù)側(cè)肘關(guān)節(jié)的屈曲功能恢復(fù)情況明顯優(yōu)于A組，B、C組部分大鼠手術(shù)側(cè)肘關(guān)節(jié)的屈曲功能恢復(fù)至30°～60°，C組還有2只手術(shù)側(cè)肘關(guān)節(jié)的屈曲功能恢復(fù)至60°～90°。見(jiàn)表1。

2.2 脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活率的檢測(cè) 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)A組與其他兩組神經(jīng)元存活率有顯著性差異(P＜0.05);B組C組有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組患側(cè)肢體屈曲功能情況(n=20，n)

表2 各組脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活率(%，±s，n=3)

表2 各組脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活率(%，±s，n=3)

與A組比較:1)P＜0.05;與B組比較:2)P＜0.05

組別1 w 2 w 4 w 8 w A組50.1±4.2 40.8±3.4 34.3±2.2 21.4±1.5 B 組 66.3±4.11) 52.4±3.11) 41.5±2.81) 38.1±2.41)C 組 78.1±5.21)2)76.4±3.41)2)73.2±3.11)2)68.3±2.21)2)

3 討論

臂叢神經(jīng)根性撕脫傷是神經(jīng)根的軸突在靠近細(xì)胞體處斷裂，神經(jīng)根遠(yuǎn)端開(kāi)始發(fā)生Waller變性，另外受損的神經(jīng)隨之發(fā)生逆向性變性，引起脊髓相應(yīng)節(jié)段的神經(jīng)元死亡，結(jié)果導(dǎo)致患側(cè)肢體出現(xiàn)嚴(yán)重的功能障礙，預(yù)后差。這需要臨床醫(yī)生與細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的研究人員緊密配合，采取綜合性的治療手段〔2，3〕。以神經(jīng)回植重建神經(jīng)通路的連續(xù)性，再移植 NSCs與SCs用以激活損傷區(qū)域周?chē)幱谛菝郀顟B(tài)的神經(jīng)元，移植的細(xì)胞還能夠彌補(bǔ)局部缺失的神經(jīng)元，保護(hù)、挽救受傷的神經(jīng)元，以達(dá)到改善局部微環(huán)境、促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生、神經(jīng)元數(shù)量的恢復(fù)，最終使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的患肢功能得以改善。

對(duì)于建立臂叢神經(jīng)根性撕脫傷動(dòng)物模型，國(guó)內(nèi)外學(xué)者所采取的方法不盡相同。Yamada等〔4〕采用神經(jīng)移位的方法利用同側(cè)C3、C4神經(jīng)根來(lái)修復(fù)損傷的C5、C6神經(jīng)根，效果較好。本文采用經(jīng)頸后正中切口，沿棘突旁作頸后肌群骨膜下剝離，切除一側(cè)半椎板，顯露椎管內(nèi)、外神經(jīng)根結(jié)構(gòu)，采取切斷大鼠C5、C6、C7神經(jīng)根，再把神經(jīng)根近端撕脫，術(shù)后定期進(jìn)行電生理學(xué)及肌肉功能等方面檢測(cè)，結(jié)果表明:上述制備臂叢神經(jīng)根性撕脫傷動(dòng)物的方法令人滿意。此方法的優(yōu)點(diǎn)是手術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，術(shù)區(qū)出血少，術(shù)野清晰，不易損傷重要組織結(jié)構(gòu)，神經(jīng)根及脊髓顯露充分。本實(shí)驗(yàn)表明:治療臂叢神經(jīng)根性撕脫傷，神經(jīng)回植術(shù)是局部修復(fù)的基礎(chǔ)，而細(xì)胞移植對(duì)于損傷的修復(fù)具有重要意義。

Nakamura等〔5〕把經(jīng)體外擴(kuò)增的人NSCs用TP標(biāo)記后移植到臂叢根性撕脫傷獼猴的相應(yīng)脊髓節(jié)段內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人的NSCs可以在獼猴體內(nèi)存活、遷移，并且有部分細(xì)胞進(jìn)行了分化，還觀察到獼猴患側(cè)上肢運(yùn)動(dòng)功能明顯優(yōu)于對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)提示，SCs對(duì)NSCs有支持、保護(hù)及營(yíng)養(yǎng)作用，其在局部所形成的微環(huán)境更促進(jìn)NSCs分化為有功能的神經(jīng)元。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在神經(jīng)根回植術(shù)聯(lián)合NSCs與SCs移植能夠起到對(duì)損傷局部神經(jīng)元的保護(hù)作用。

利用NSCs和SCs共移植治療臂叢神經(jīng)根性撕脫傷的確切機(jī)制雖然還不甚明了，可能與下列因素有關(guān):①通過(guò)神經(jīng)根回植術(shù)，恢復(fù)損傷神經(jīng)組織的解剖結(jié)構(gòu)，修復(fù)受損的神經(jīng)通路;②植入的NSCs在局部存活并產(chǎn)生諸如多肽類、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子類等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可以促進(jìn)局部損傷神經(jīng)組織的修復(fù);③SCs與NSCs的共移植，SCs為NSCs提供生長(zhǎng)、發(fā)育所需要的骨架，為NSCs提供生長(zhǎng)所必需的多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。此外，SCs還能參與構(gòu)成有利于NSCs向功能神經(jīng)元方向分化的微環(huán)境。

1 朱清遠(yuǎn)，王玉發(fā)，王國(guó)君，等.臂叢神經(jīng)根性撕脫傷動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.吉林醫(yī)學(xué)，2003;24(2):133-5.

2 Reinebrant HE，Wixey JA，Gobe GC，et al.Differential effects of neonatal hypoxic-ischemic brain injury on brainstem serotonergic raphe nuclei〔J〕.Brain Res，2010;1322:124-33.

3 Naghdi M，Tiraihi T，Namin SA，et al.Transdifferentiation of bone marrow stromal cells into cholinergic neuronal phenotype:a potential source for cell therapy in spinal cord injury〔J〕.Cytotherapy，2009;11(2):137-52.

4 Yamada S，Peterson GM，Soloniuk D，et al.Coaptation of the anterior rami of C3 and C4 to the upper trunk of the brachial plexus for cervical nerve root avulsion〔J〕.J Neurosurg，1991;74(2):171-7.

5 Nakamura M，Toyama Y，Okano H.Transplantation of neural stem cells for spinal cord injury〔J〕.Rinsho Shinkeigaku，2005;45(11):874-6.

R74

A

1005-9202(2015)09-2331-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.011

黑龍江省自然科學(xué)基金(H201359);黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12521538)

孫國(guó)娟(1976-)，女，主管護(hù)師，主要從事脊柱外科患者圍術(shù)期護(hù)理的研究。

李曉濤(1974-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事周?chē)窠?jīng)損傷與修復(fù)研究。

〔2013-12-19修回〕

(編輯 張 慧)