雞源里默菌的分離和鑒定

劉發(fā)志，李占鴻，尹金花，蘇敬良

（1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化工學(xué)院，湖北 宜昌443000 ；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動物流行病學(xué)與人獸共患病重點實驗室，北京 海淀100193）

里默菌為革蘭陰性、無芽孢、多形態(tài)桿菌，屬于黃桿菌科里默菌屬，包括鴨疫里默菌（Riemerella anatipestifer）、鴿里默菌（R.columbina）和鴿咽里默菌（R.columbipharyngis），以及部分尚未完全能確定分類地位的分離株[1-3]。該屬細(xì)菌主要分自于家禽和野生鳥類，其中，以鴨疫里默菌感染分布范圍最廣，特別是商品肉鴨的感染給我國水禽養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟損失。有關(guān)該屬其他成員的報道逐漸增加，如從有呼吸道癥狀或外表健康的家養(yǎng)鴿子以及鴕鳥中分離到的鴿里默菌和鴿咽里默菌[4-5]。近期的研究發(fā)現(xiàn)早期從病雞呼吸道分離的巴氏桿菌屬的部分分離株與里默菌關(guān)系密切，但與本屬已鑒定種存在一定的差異，并將其暫時歸類為里默菌分類2 群（Riemerella-like taxon 1）。本試驗自雞呼吸道分離到1 株革蘭陰性桿菌，經(jīng)過分子生物學(xué)檢測該菌株與里默菌分類2 群分離株高度同源。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌分離 病料為送檢50 日齡死亡雞，雞群在送檢期間有呼吸道癥狀雞的數(shù)量呈上升趨勢，剖檢內(nèi)部臟器未見有特征性的肉眼病變。完整剝離病雞氣管，在無菌工作臺內(nèi)用滅菌剪刀將氣管中后段剪開，用滅菌緩沖液浸濕的棉拭子涂擦氣管內(nèi)壁采樣并直接接種于含5%綿羊血的胰蛋白大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基上，在燭缸中37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.2 細(xì)菌鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 挑選單個菌落在添加2%小牛血清的TSA 瓊脂平板劃線培養(yǎng)，經(jīng)3 次連續(xù)傳代純化獲得大小和形態(tài)基本一致的菌落后凍存，同時用接種環(huán)挑取細(xì)菌培養(yǎng)物涂布于載玻片上，火焰固定后進(jìn)行革蘭染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)。

1.2.2 16S rRNA 和rpoB 基因序列分析 將分離細(xì)菌接種于含2%血清的胰酶大豆肉湯（TSB）中，37 ℃搖振過夜，離心收集菌體，利用細(xì)菌DNA 純化試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，以細(xì)菌16S rRNA 通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/1429R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和rpoB 基因通用引物（rpoBF：5′-GTTATCAACTCTTTCTTTGGTAC-3′/rpoBR：5′-GCATCATATTAGAACCCAT-3′）進(jìn)行目的基因擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行核酸序列測定，并與NCBI 數(shù)據(jù)庫相關(guān)基因序列進(jìn)行比對和分析。

1.3 細(xì)菌生長曲線測定 挑取純化的單菌落，接種于含2%胎牛血清的TSB 培養(yǎng)基，37 ℃搖振培養(yǎng)16 h（200 r/min），獲得種子液；用TSB 調(diào)節(jié)菌液OD600nm=0.1，吸取1 mL 菌液接種于200 mL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃搖振培養(yǎng)16 h（200 r/min），每1 h取1 次樣，利用分光光度計測樣品OD600nm 值，繪制細(xì)菌生長曲線。

1.4 藥敏試驗 挑取純化的單菌落，接種于含2%胎牛血清的TSB 培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 搖振培養(yǎng)過夜，調(diào)整細(xì)菌濃度至108CFU/mL 左右，均勻涂布于TSA 平板上，用無菌眼科鑷子將藥敏紙片輕輕貼于平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，測量抑菌圈直徑。

1.5 致病性試驗 將50 只5 日齡商品代北京鴨分成靜脈注射組20 只，呼吸道感染組20 只，未感染對照組10 只，分別飼養(yǎng)于負(fù)壓禽用隔離器中。靜脈注射組每只靜脈注射0.5 mL 新鮮菌液（4×109CFU），呼吸道感染組每只滴鼻感染0.2 mL 菌液（1.5×109CFU）。觀察記錄發(fā)病情況。分別于感染后1、3、7 d 每組各撲殺3 只，從血液、肝臟、肺臟和氣管中進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)和形態(tài)特征 1 份50 日齡的雞氣管樣品接種至在添加5%血液的TSA 平板培養(yǎng)24 h 后上生長有較為一致的直徑1～2 mm、灰白色、表面隆起、光滑、濕潤的菌落，菌體革蘭染色為陰性短桿狀。經(jīng)純化培養(yǎng)后，在TSB 培養(yǎng)基中生長良好。細(xì)菌接種至新鮮TSB 培養(yǎng)基中經(jīng)過約4 h 適應(yīng)后進(jìn)入對數(shù)生長期，之后在接種后11 h進(jìn)入穩(wěn)定增長期。

2.2 菌株16S rRNA 和rpoB 基因序列測定及分析

采用PCR 技術(shù)對分離株16S rRNA 基因進(jìn)行擴增獲得預(yù)期的目的片段，序列分析結(jié)果獲得1 158 nt 可讀序列。比對分析結(jié)果顯示，該分離株與鴨疫里默菌16S rRNA 基因的同源性為95.8%，與鴿咽里默菌模式菌8157 株16S rRNA 基因同源性為97.1%，而與里默菌第2 分類群（Riemerella-like taxon 2）的分離株IPDH359/90和IPDH98/90的同源性為98.7%。rpoB基因序列分析結(jié)果顯示，該分離株與IPDH 359/90 株相應(yīng)基因片段的同源性達(dá)100%，而與鴿咽里默菌相應(yīng)片段的同源性為83%。進(jìn)化分析結(jié)果進(jìn)一步證明HB2013 株與該分類群處于同一分支中（圖1）。綜合16S rRNA 和rpoB 基因分析結(jié)果，將該分離株歸類為里默菌第2 分類群，命名為里默菌HB2013 株（Riemerella sp.HB2013）。

2.3 藥敏試驗 紙片擴散法檢測分離細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在試驗所用的23 種抗菌藥物中，該菌株對頭孢哌酮、頭孢哌酮/舒巴坦、大觀霉素、頭孢西丁、阿莫西林-克拉維酸、左氧氟沙星、利福平高度敏感；對青霉素、氨芐西林、新霉素、阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、羅紅霉素、頭孢噻肟、頭孢吡肟、克林霉素、萬古霉素和四環(huán)素中度敏感；對諾氟沙星低度敏感；對阿奇霉素和磺胺甲噁唑不敏感。

2.4 致病性試驗 經(jīng)靜脈注射和滴鼻兩種途徑感染5 日齡雛鴨與未感染對照組相比，在試驗期內(nèi)均未表現(xiàn)任何異常。滴鼻感染組在感染后24 h，僅在氣管中分離到少量細(xì)菌；兩個感染組在感染3 天后，在血液、肝臟、肺臟和氣管中均未能分離到該細(xì)菌。

3 討論

到目前為止，絕大多數(shù)里默菌分自鴨、鵝、火雞或鴿，其他宿主來源則較少。我國里默菌感染主要見于水禽（鴨和鵝），是商品肉鴨和鵝最常見的細(xì)菌性傳染病之一，但雞源里默菌的分離在國內(nèi)較為少見。本研究從雞的氣管中分離到里默菌HB2013 株的16S rRNA 基因與鴿咽里默菌，以及Christensen 和Bisgaard 報道[1]的里默菌第2 分類群菌株的同源性均高于97%，但rpoB 基因分析結(jié)果顯示，HB2013 株與前者有顯著地差異，與后者高度同源，因此我們將該菌株暫時鑒定為里默菌第2 分類群，其確切歸類可能需要做進(jìn)一步的表型和遺傳學(xué)特征分析。雖然初步研究表明，該菌株對雛鴨沒有明顯的致病性，但其對雞的感染有待進(jìn)一步探討。

[1] Christensen H，Bisgaard M.Phylogenetic relationships of Riemerella anatipestifer serovars and related taxa and an evaluation of specific PCR tests reported for R.anatipestifer [J].Journal of Applied Microbiology，2010，108：1612-1619.

[2] Rubbenstroth D，Martin Ryll M，Hotzel H，et al.Description of Riemerella columbipharyngis sp.nov，isolated from the pharynx of healthy domestic pigeons（Columba livia f.domestica），and emended descriptions of the genus Riemerella，Riemerella anatipestifer and Riemerella columbina [J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2013，63：280-287.

[3] Vancanneyt M，Vandamme P，Segers P，et al.Riemerella columbina sp.nov.a bacterium associated with respiratory disease in pigeons [J].International Journal of Systematic Bacteriology，1999，49:：289-295.

[4] RubbenstrothD，Hotzel H，Knobloch J，et al.Isolation and characterization of atypical Riemerella columbina strains from pigeons and their differentiation from Riemerella anatipestifer [J].Veterinary Microbiology，2011，147：103-112.

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