高脂膳食與運動對小鼠腦內(nèi)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因表達的影響

云少君 喬 欣 李 蔓 魏守剛

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太原 030801)

cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元生成、突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶等方面〔1〕，其異常表達及活性變化參與了某些神經(jīng)退行性疾病的病理生理過程〔2〕。近年來許多研究顯示〔3〕腦老化性學(xué)習(xí)記憶功能障礙的原因之一是衰老過程中腦神經(jīng)元大量凋亡。生活方式能影響神經(jīng)功能，特別是富含脂類的飲食結(jié)構(gòu)能夠?qū)е吕匣^程中的認知障礙〔4〕，加速阿爾茨海默病(AD)的癡呆過程〔5〕，而運動是抗衰老保護腦健康的有效措施之一。本研究擬觀察腦老化情況下CREB基因的表達情況，同時進行高脂膳食和運動干預(yù)，探討不同生活方式對腦老化的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組與處理 70只雄性美國癌癥研究所(ICR)小鼠按體重隨機分為普通對照組、高脂對照組、運動對照組、普通腦老化組、腦老化+高脂組、腦老化+運動組及腦老化+高脂+運動組。腦老化小鼠模型的建立參見文獻〔6〕，本實驗皮下注射D-半乳糖的劑量調(diào)整為50 mg/kg(1次/d，連續(xù)10 w)，對照組小鼠注射等量生理鹽水。按文獻〔7〕特制高脂鼠料:79%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物科學(xué)部加工)。小鼠運動訓(xùn)練方案參照文獻〔8，9〕進行，經(jīng)預(yù)實驗調(diào)整后確定為:小鼠在電動跑臺上每周訓(xùn)練6 d，每天跑步500 m，其中第1周以10 m/min的速度運動，以后每周跑步速度遞增5 m/min，至第4周增至25 m/min后維持該速度運動直至實驗結(jié)束，實驗期共10 w。

1.2 Morris水迷宮試驗 參照文獻〔10〕進行 Morris水迷宮實驗。本實驗中調(diào)整為:水迷宮試驗每天測試1次，共進行7 d，學(xué)習(xí)期為開始3 d，將小鼠放在站臺上熟悉15 s后再下水航行，若2 min內(nèi)不能自動找到站臺，則人工幫助其登陸站臺并停留15 s以學(xué)習(xí)記憶;鞏固期為其后2 d，小鼠自由航行2 min尋停站臺，人工不再幫助其登陸站臺。第6、7天進行正式測試，逃避潛伏期測試數(shù)據(jù)平均值用于小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的分析，若2 min內(nèi)不能自動找到站臺則記錄為逃避潛伏期120 s。

1.3 CREB基因表達測定(RT-PCR法)Morris水迷宮實驗結(jié)束后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取腦組織(去除小腦)稱重，置于液氮速凍后于－70℃冰箱保存待測。以RT-PCR法測定CREB基因的表達水平。具體實驗操作見相關(guān)試劑盒說明書。引物序列:CREB:5'-TCA GCCGGGTACTACCAT TC-3'及5'-TCT CTT GCT GCT TCC CTG TT-3'。內(nèi)參照β-actin:5'-GTT ACCAAC TGG GAC GAC A-3'及5'-GGA ACC GCT CGT TGC CAA-3'。PCR 擴增條件:CREB:94℃ 3 min，94℃ 30 s→55℃30 s→72℃ 1 min，30 個循環(huán)后，72℃ 10 min。β-actin:94℃3 min，94℃ 45 s→60℃ 60 s→72℃ 60 s，35 個循環(huán)后，72℃5 min。采用凝膠成像分析系統(tǒng)對擴增產(chǎn)物的電泳分離條帶進行灰度值測定，計算目的基因擴增產(chǎn)物與內(nèi)參基因擴增產(chǎn)物灰度值的比值表示目的基因表達的相對量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS17.0進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力測評 Morris水迷宮行為學(xué)實驗結(jié)果表明腦老化小鼠模型建模成功。普通腦老化組〔(59.33±25.54)s〕與腦老化+高脂組〔(56.42±10.20)〕s小鼠的逃避潛伏期均大于普通對照組〔(32.58±8.99)〕s(P＜0.05)。腦老化+運動組小鼠的逃避潛伏期〔(24.75±8.72)〕s低于普通腦老化組(P＜0.05)，與普通對照組相比差異顯著。腦老化+高脂+運動組小鼠的逃避潛伏期〔(53.67±14.94)s〕大于普通對照組(P＜0.05)，與普通腦老化組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。高脂對照組小鼠的逃避潛伏期〔(58.10±4.74)〕s大于普通對照組(P＜0.05)，運動對照組〔(31.17±8.98)s〕與普通對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 CREB基因表達情況 普通腦老化組小鼠腦CREB基因表達水平(0.68±0.35)低于普通對照組(3.24±0.80)(P＜0.05)。腦老化+高脂組小鼠腦CREB基因表達水平(0.58±0.25)低于普通對照組(P＜0.05)，與普通腦老化組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。腦老化+運動組小鼠腦CREB基因表達水平(2.01±1.28)高于腦老化組(P＜0.05)，與普通對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。腦老化+高脂+運動組(0.99±0.66)與普通對照組相比表達量降低(P＜0.05);與普通腦老化組相比雖有所增高，但無統(tǒng)計學(xué)差異。與普通對照組相比，高脂對照組(0.52±0.12)有所降低(P＜0.05);運動對照組CREB基因表達水平(1.73±0.20)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

本實驗結(jié)果表明:(1)D-半乳糖誘導(dǎo)性腦老化小鼠CREB基因表達下降，這種變化與以前關(guān)于神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)元凋亡關(guān)系的報道相似〔11〕。作為細胞存活因子信息轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的最后一個成分，通過其分子中Ser-133的磷酸化，CREB由無活性型轉(zhuǎn)變成活性型，結(jié)合到相關(guān)基因，引起靶基因的表達〔11，12〕，而發(fā)揮抑制凋亡作用。對正常老齡大鼠的研究，也發(fā)現(xiàn)有腦神經(jīng)元大量凋亡現(xiàn)象，因為神經(jīng)系統(tǒng)接受、處理和儲存信息的能力在某種程度上與細胞數(shù)量相關(guān)，因此這可能是腦老化性學(xué)習(xí)記憶功能障礙的原因之一。(2)高脂膳食使小鼠的CREB基因表達下降，但是其與D-半乳糖并無明顯的協(xié)同作用。高脂膳食使血管和血液流變學(xué)參數(shù)發(fā)生負性改變，能夠?qū)е卵軓椥韵陆怠⒀吼仍黾?、血流速度減緩等，造成大腦供血供氧不足，并且長期脂肪酸攝入過多，使脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生增加。這些變化直接促進腦內(nèi)自由基形成增多，而腦組織由于相對地缺乏GSH等抗氧化物質(zhì)，故易發(fā)生過氧化反應(yīng)，進一步導(dǎo)致腦組織氧化損傷，進而引起神經(jīng)元的過度凋亡。(3)運動可以防止腦老化小鼠的CREB基因表達下調(diào)，延緩腦老化。腦老化過程中給予運動干預(yù)能夠抵制CREB mRNA表達的不斷下調(diào)，對抗神經(jīng)元凋亡，從而達到延緩腦老化的作用。本研究還顯示，運動對正常小鼠腦內(nèi)CREB基因表達并無明顯上調(diào)作用，運動通過影響神經(jīng)元凋亡而保護腦健康的效應(yīng)可能更主要的體現(xiàn)在抗腦老化過程中。

因此，本研究提示老年人避免長期高脂膳食及堅持運動鍛煉對于預(yù)防腦老化、促進腦健康有長遠的現(xiàn)實意義。

1 宋海龍，鄭 焱，王曉民.CREB信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)中的調(diào)控及功能〔J〕．中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2013;29(9):797-804.

2 Leutgeb JK，F(xiàn)rey JU，Behnisch T.Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures〔J〕．Neuroscience，2005;131(3):601-10.

3 Winter E.Effects of an extract of Ginkgo biloba on learning and memory in mice〔J〕．Pharmacol Biochem Behav，1991;38(1):109.

4 Chen KS，Masliah E，Mallory M，et al．Synatic loss in cognitively impaired aged rats is ameliorated by chronic human nerve growth factor infusion〔J〕．Neuroscience，1995;68(1):19-27.

5 Kalmijn S，F(xiàn)oley D，White L，et al．Metabolic cardiovascular syndrome and risk of dementia in Japanese-American elderly men:the Honolulu-A-sia aging study〔J〕．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000;20:2255-60.

6 龐在英，李桂榮，杜怡峰.海風(fēng)藤提取物對D-半乳糖腦老化模型小鼠行為、海馬神經(jīng)細胞線粒體膜電位及凋亡的影響〔J〕．中國老年學(xué)雜志，2007;16(27):1555-57.

7 Koudinov AR，Koudinova NV.Essential role for cholesterol in synaptic plasticity and neuronal degeneration〔J〕．FASEB J，2001;15:1858-60.

8 程志清，龔立波，姚 立.強迫跑步法建立 BALB/C小鼠心氣虛證模型〔J〕．浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003;27(6):42-5.

9 杜少武，吳紀饒.復(fù)方白蟻制劑對訓(xùn)練大鼠血清睪酮、皮質(zhì)醇的影響〔J〕．中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2005;24(6):714-5.

10 高秋菊，勾凌燕，王 憬，等.不同劑量碘對迷宮前后鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)的影響〔J〕．中國公共衛(wèi)生，2005;21(6):710-11.

11 Yuan J，Yankner BA.Apoptosis in the nervous system〔J〕．Nature，2000;407(7):802-9.

12 Lambeng N，Michel PP，Brugg B，et al．Mechanisms of apoptosis in PC12 cells irreversibly differentiated with nerve growth factor and cyclic AMP〔J〕．Brain Res，1999;821(1):60-8.