房顫動(dòng)物模型及其在細(xì)胞和分子療法研究中的應(yīng)用進(jìn)展

黃家園,吳劍,楊豐華2,4,陳燦

(1.廣東醫(yī)學(xué)院,廣東 湛江　524023；2.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州　510663；3.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院,上?！?00032；

4.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所,廣州　510663；5.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣東 湛江　524023)

?

房顫動(dòng)物模型及其在細(xì)胞和分子療法研究中的應(yīng)用進(jìn)展

黃家園1,2,吳劍3,楊豐華2,4,陳燦5*

(1.廣東醫(yī)學(xué)院,廣東 湛江524023；2.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州510663；3.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院,上海200032；

4.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所,廣州510663；5.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣東 湛江524023)

【摘要】房顫是多原因引起的心律失常，可導(dǎo)致運(yùn)輸?shù)礁髌鞴俳M織的血量不足，引發(fā)血栓、心衰或其他相關(guān)的復(fù)雜病情。房顫的動(dòng)物模型分類根據(jù)其疾病的癥狀或誘發(fā)因素可分為電生理性模型、神經(jīng)激素和血管生理失常模型和結(jié)構(gòu)變異模型等。不斷涌現(xiàn)的新技術(shù)如microRNA、CRISPR-Cas9體系等為構(gòu)建房顫疾病動(dòng)物模型提供了新的技術(shù)手段并引導(dǎo)其在療法研究上的應(yīng)用新方向。目前房顫治療方法的研究已經(jīng)從傳統(tǒng)的侵入式電生理方法和抗心律失常藥物的使用轉(zhuǎn)向細(xì)胞和分子療法，并在房顫分子機(jī)理、靶向治療和藥物篩選等方面都有重要的新進(jìn)展。本文綜述了幾類常見的房顫動(dòng)物模型的構(gòu)建和特性及其在細(xì)胞和分子療法研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】房顫；動(dòng)物疾病模型；細(xì)胞和分子療法；疾病分子機(jī)理

房顫是由心房主導(dǎo)折返環(huán)引起許多小折返環(huán)導(dǎo)致的心房節(jié)律紊亂，表現(xiàn)為心跳頻率快而不規(guī)則。房顫的發(fā)生和先天性的基因改變或心房基質(zhì)的改變(重構(gòu))密切相關(guān)。據(jù)流行病學(xué)的調(diào)查我國約有0.65%的人口受累于房顫，這個(gè)數(shù)字并隨著社會(huì)人口的老齡化而增長[1]，2013年的《中國心血管病報(bào)告》中指出在心內(nèi)科住院患者中約有10%是因房顫入院[2]。目前房顫的治療和預(yù)防仍然是個(gè)難題，一方面藥物的副作用使超過一半的的患者不得不放棄使用，另一方面在房顫治療中常用的除顫器和不斷改善的射頻消融技術(shù)也各有其缺點(diǎn)—前者容易并發(fā)功能性的損傷[3]，而后者的作用具有局限性[4, 5]。因此研究新的房顫治療方法、開發(fā)新的動(dòng)物疾病模型勢(shì)在必行。由于對(duì)房顫疾病機(jī)理的深入了解及分子生物工程技術(shù)在動(dòng)物建模上的廣泛應(yīng)用，使細(xì)胞和分子療法的研究取得了快速的發(fā)展。本文綜述了現(xiàn)代房顫動(dòng)物模型的構(gòu)建及其在細(xì)胞和分子療法研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

1房顫動(dòng)物模型

房顫的動(dòng)物模型是指各種自發(fā)或人工誘導(dǎo)的具有房顫表型的動(dòng)物模型，其廣泛應(yīng)用于研究房顫的病理生理如離子電流的改變、結(jié)構(gòu)改變和分子信號(hào)的調(diào)控。房顫動(dòng)物模型根據(jù)其疾病的癥狀或誘發(fā)因素可分為電生理性模型、神經(jīng)激素和血管生理異常常模型以及結(jié)構(gòu)變異模型等。必須注意的是這些模型之間有不少表現(xiàn)型是重復(fù)的，這個(gè)歸納分類只是為了讓閱讀此文的研究者們可以更方便的追溯參考文獻(xiàn)。

1.1動(dòng)物電生理模型

房顫的電生理模型是指根據(jù)心肌的電生理特性結(jié)合房顫產(chǎn)生的機(jī)理來構(gòu)建的動(dòng)物模型。房顫引起的主要問題之一是心房內(nèi)產(chǎn)生的沖動(dòng)沒有傳導(dǎo)到心室并使之充盈，或者傳導(dǎo)過量直接導(dǎo)致心動(dòng)過速，其直接誘因是心肌細(xì)胞中4大離子通道系統(tǒng)包括鈉、鈣、鉀、和氯通道體系中某個(gè)或某些離子通道基因的突變?；谶@個(gè)機(jī)理，房顫的電生理模型是通過局部給予心臟電刺激和改變心律來構(gòu)建，如在犬、羊、豬等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上產(chǎn)生的房性心動(dòng)過速模型[6-8]。其次，拉伸心房產(chǎn)生房顫模型也相對(duì)容易制作，這項(xiàng)技術(shù)可以在體外完成。我們項(xiàng)目組通過連接生理記錄儀和離體心臟灌流系統(tǒng)記錄到了典型的房顫信號(hào)并檢測(cè)到調(diào)控心律的信號(hào)分子翻譯后再修飾的異常(本實(shí)驗(yàn)室的未發(fā)表數(shù)據(jù))。另外，給與心房化學(xué)性的刺激如烏頭堿等都是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室較常用的方法。

對(duì)動(dòng)物電生理特性的改造隨著基因操縱技術(shù)的發(fā)展而日漸成熟。目前已經(jīng)具備了培育各種攜帶突變或過表達(dá)離子通道基因并具有房顫表型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的技術(shù)，如已應(yīng)用于研究的過表達(dá)內(nèi)向整流鉀離子通道Kir2.1的房顫模型[9]。同時(shí)，近十年來發(fā)展的局部的、非性繁殖依賴型的基因改造技術(shù)也為研究者們提供了新的工具,如siRNA基因表達(dá)下調(diào)技術(shù)或多肽轉(zhuǎn)染技術(shù)。更引人注目的是近年發(fā)展的能夠快速編輯基因的CRISPR-Cas9技術(shù)體系，它使構(gòu)建具有房顫表型的動(dòng)物模型能夠快速高效的完成，極大的發(fā)揮了大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在研發(fā)房顫細(xì)胞和分子療法上的優(yōu)勢(shì)。

1.2神經(jīng)激素和血管生理異常的動(dòng)物模型

神經(jīng)激素和血管異常模型的構(gòu)建是以房顫的誘因是循環(huán)系統(tǒng)或內(nèi)分泌異常為依據(jù)。自主神經(jīng)調(diào)控、腎上腺素機(jī)制的改變以及肺靜脈在左心房上延伸部分的解剖結(jié)構(gòu)異常都可導(dǎo)致房顫[10, 11]。在此類模型中神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的模型特別是迷走神經(jīng)刺激引起的房顫模型最為廣泛使用，其特點(diǎn)是制作成本低、穩(wěn)定、容易制作并且不涉及復(fù)雜的疾病機(jī)理。其次利用腎上腺素型對(duì)離子通道的異常調(diào)控而致房顫的模型也較為常用。此外，局部性的電子活動(dòng)和左房斜靜脈相關(guān)的發(fā)現(xiàn)直接導(dǎo)致了現(xiàn)代房顫治療中常用的射頻消融療法的發(fā)展。

1.3結(jié)構(gòu)重構(gòu)性動(dòng)物模型

結(jié)構(gòu)重構(gòu)模型是根據(jù)房顫發(fā)生的組織學(xué)特性而構(gòu)建。心衰可繼發(fā)于各種充血性心衰、二尖瓣返流、非感染性心包炎、房室阻滯、慢性容量超負(fù)荷、高血壓、過負(fù)荷運(yùn)動(dòng)等，表現(xiàn)為心房壓力和體積的改變以及心臟功能和機(jī)體的需求不匹配的現(xiàn)象。這種不匹配可引起心臟結(jié)構(gòu)的重構(gòu)，在早期心臟尚能代償部分輸出功能的不足，但是隨著不可逆的重構(gòu)進(jìn)程的發(fā)展，傳導(dǎo)的不均一性和間質(zhì)纖維化也逐漸出現(xiàn)，并最終導(dǎo)致了房顫發(fā)生。在構(gòu)建此類動(dòng)物模型時(shí)，各種可致心臟結(jié)構(gòu)異常的方法例如冠狀動(dòng)脈結(jié)扎、主動(dòng)脈狹窄、過量運(yùn)動(dòng)等被廣泛的應(yīng)用于誘導(dǎo)繼發(fā)性房顫。除此以外，操縱信號(hào)調(diào)控系統(tǒng)也可誘導(dǎo)重構(gòu)型房顫，例如激活轉(zhuǎn)化生長因子-beta1或過表達(dá)腫瘤壞死因子-alpha[9]。

2房顫動(dòng)物模型在細(xì)胞和分子療法研究中的應(yīng)用進(jìn)展

房顫的細(xì)胞和分子療法涵蓋了干細(xì)胞治療、基因修飾、microRNA治療等領(lǐng)域。作為一種新興的療法，房顫的細(xì)胞和分子療法在各方面都有待完善。研究者們直到1999年在才在共聚焦顯微鏡技術(shù)的幫助下確認(rèn)人的心肌細(xì)胞具有增生能力[12]，這極大的支持了心臟再生和心血管疾病的細(xì)胞分子療法的研發(fā)。雖然自美國FDA于1992年第一次批準(zhǔn)基因治療進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段到現(xiàn)在，已經(jīng)有超過2000例正在進(jìn)行基因治療的各級(jí)臨床試驗(yàn)[13]，但是其中并沒有一個(gè)由FDA批準(zhǔn)的特定的針對(duì)房顫基因治療的臨床試驗(yàn)[14]。這提示了應(yīng)用房顫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型在驗(yàn)證各種細(xì)胞和分子療法的效果方面仍有很大的發(fā)展空間，最新研究進(jìn)展如下。

2.1房顫的機(jī)理和靶向治療

動(dòng)物模型在確定治療房顫的靶向中可幫助確定哪些基因?qū)Υ思膊〉陌l(fā)生起決定性的作用。首先是利用這些模型來發(fā)現(xiàn)房顫發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)理，例如研究者們利用房顫動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)了房顫與鈉離子電流密切相關(guān)，當(dāng)鈉通道基因SCN5A的突變、心衰或心功能急性改變時(shí)都可以導(dǎo)致鈉電流的改變。其次，房顫動(dòng)物模型可以協(xié)助確定哪個(gè)是起決定作用的調(diào)控體系。例如在驗(yàn)證抗節(jié)律異常的基因治療中，豬的短陣快速起搏引起的房顫模型使研究者們能夠在短期內(nèi)驗(yàn)證連接蛋白-43(connexin-43)基因的表達(dá)[15]和突變[16]都是決定因素，而抑制G蛋白的alpha亞單位[17]可以防止房顫的發(fā)生。在了解了某個(gè)基因能夠決定疾病的機(jī)理后，研究者們需要進(jìn)一步的探索在房顫發(fā)生時(shí)這些基因的改變是受哪些機(jī)理調(diào)控的，這個(gè)過程也依賴于使用合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來驗(yàn)證。例如在確定了一個(gè)可抑制G蛋白信號(hào)受體基因后，把此基因表達(dá)的蛋白注射于豬心臟起搏組織來驗(yàn)證其是否能直接控制心律[18]。

2.2治療效果的評(píng)價(jià)

應(yīng)用房顫動(dòng)物模型來評(píng)價(jià)細(xì)胞和分子療法使研究者們可以直觀的判定結(jié)果，判定這個(gè)新療法能否調(diào)控細(xì)微而復(fù)雜分子機(jī)理并達(dá)到修復(fù)受損的傳導(dǎo)體系的目的。目前已有不少實(shí)驗(yàn)室利用不同物種制作的模型對(duì)防治房顫的療法進(jìn)行了評(píng)價(jià)，在豬的模型中發(fā)現(xiàn)了鉀通道的抑制劑[19]或者減少連接蛋白-43都可以減少房顫[15]，在狗的模型中發(fā)現(xiàn)了應(yīng)用成纖維細(xì)胞可延長房室結(jié)的傳導(dǎo)時(shí)間[20]，在豬植入心臟起搏器引發(fā)心房快速起搏器的模型中發(fā)現(xiàn)了減少caspase-3的活性也可以抑制房顫的發(fā)生。

2.3新的分子治療技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為房顫治療提供了新的手段。新技術(shù)如MicroRNA敲除和過表達(dá)、CRISPR-Cas9基因修飾體系的出現(xiàn)，使研究者們?cè)诟钊氲牧私夥款澋姆肿訖C(jī)理外還能夠利用此技術(shù)來發(fā)展新的房顫療法。其中最典型的研究結(jié)果是發(fā)現(xiàn)敲除miR-106b-25-/-基因可以改善小鼠的房顫狀況，并確定了這和心肌細(xì)胞內(nèi)控制鈣的受體有直接關(guān)系[21]。由于鈣離子失常是房顫的主要引發(fā)因素之一，這個(gè)研究結(jié)果提示了改變特定的MicroRNA基因可能是一個(gè)非常直接而有效的治療方法。另外，利用CRISPR-Cas9的基因操縱原理來減少或清除房顫的誘因也是一個(gè)正在探索的方法。研究者們順利的應(yīng)用此技術(shù)在羊上敲除了一個(gè)導(dǎo)致房顫的基因[22]，表明了利用CRISPR-Cas9的基因編輯體系來確定藥物靶點(diǎn)和發(fā)展療法具有可行性。除此以外, 在房顫治療上，分子療法和傳統(tǒng)療法結(jié)合也是一個(gè)趨勢(shì)，例如，離子通道抑制劑和抗凝血?jiǎng)┑穆?lián)合使用[23]效果已經(jīng)在動(dòng)物模型上得到了驗(yàn)證。

3結(jié)論和展望

房顫疾病動(dòng)物模型已經(jīng)被廣泛用來闡明疾病發(fā)生的分子機(jī)理和識(shí)別病灶，并通過與成像、記錄、導(dǎo)管、消融等新技術(shù)結(jié)合，使治療房顫的細(xì)胞和分子療法的研究從基礎(chǔ)到臨床前試驗(yàn)等各方面都取得了巨大的進(jìn)展。同時(shí)，當(dāng)前的研究對(duì)象也轉(zhuǎn)向了多基因遺傳病相關(guān)的房顫如冠心病和心衰卒死而不只是局限于傳統(tǒng)的遺傳性房顫，從而使探索細(xì)胞和分子治療(包括干細(xì)胞治療、基因編輯/修飾、microRNA治療)的可行性成為研究熱點(diǎn)。房顫細(xì)胞和分子療法的可行性的實(shí)現(xiàn)需要從更多的活體分析和優(yōu)化疾病模型入手，理順從復(fù)雜的遺傳多樣性到臨床表現(xiàn)型之間的關(guān)系，并對(duì)其在臨床上的個(gè)體間的遺傳變異加以考慮。

參考文獻(xiàn)

[1]Zhou Z, Hu D. An epidemiological study on the prevalence of atrial fibrillation in the Chinese population of mainland China [J]. J Epidemiol. 2008, 18: 209-216.

[2]中國心血管病報(bào)告2013編委會(huì). 中國心血管病報(bào)告2013 [G]. 北京, 國家心血管病中心; 2013.

[3]Saad EB, Marrouche NF, Martin DO, et al. Frequency and associations of symptomatic deterioration after dual-chamber defibrillator implantation in patients with ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy [J]. Am J Cardiol. 2002, 90: 79-82.

[4]Camm AJ, Kirchhof P, Lip GY, et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task Force for the Management of Atrial Fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC) [J]. Eur Heart J. 2010, 31: 2369-2429.

[5]Nishida K, Datino T, Macle L, et al. Atrial fibrillation ablation: translating basic mechanistic insights to the patient [J]. J Am Coll Cardiol. 2014, 64: 823-831.

[6]Wijffels MC, Kirchhof CJ, Dorland R, et al. Atrial fibrillation begets atrial fibrillation. A study in awake chronically instrumented goats [J]. Circulation. 1995, 92: 1954-1968.

[7]Fareh S, Villemaire C, Nattel S. Importance of refractoriness heterogeneity in the enhanced vulnerability to atrial fibrillation induction caused by tachycardia-induced atrial electrical remodeling [J]. Circulation. 1998, 98: 2202-2209.

[8]Dudley SC, Jr., Hoch NE, McCann LA, et al. Atrial fibrillation increases production of superoxide by the left atrium and left atrial appendage: role of the NADPH and xanthine oxidases [J]. Circulation. 2005, 112: 1266-1273.

[9]Nattel S, Shiroshita-Takeshita A, Brundel BJ, et al. Mechanisms of atrial fibrillation: lessons from animal models [J]. Prog Cardiovasc Dis. 2005, 48: 9-28.

[10]Arora R. Recent insights into the role of the autonomic nervous system in the creation of substrate for atrial fibrillation: implications for therapies targeting the atrial autonomic nervous system [J]. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2012, 5: 850-859.

[11]Steiner I, Hajkova P, Kvasnicka J, et al. Myocardial sleeves of pulmonary veins and atrial fibrillation: a postmortem histopathological study of 100 subjects [J]. Virchows Arch. 2006, 449: 88-95.

[12]Kajstura J, Leri A, Finato N, et al. Myocyte proliferation in end-stage cardiac failure in humans [J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95: 8801-8805.

[13]Ginn SL, Alexander IE, Edelstein ML, et al. Gene therapy clinical trials worldwide to 2012 - an update [J]. J Gene Med. 2013, 15: 65-77.

[14]Wolfram JA, Donahue JK. Gene therapy to treat cardiovascular disease [J]. J Am Heart Assoc. 2013, 2: e000119.

[15]Bikou O, Thomas D, Trappe K, et al. Connexin 43 gene therapy prevents persistent atrial fibrillation in a porcine model[J]. Cardiovasc Res. 2011;92:218-225.

[16]Soucek R, Thomas D, Kelemen K, et al. Genetic suppression of atrial fibrillation using a dominant-negative ether-a-go-go-related gene mutant [J]. Heart Rhythm. 2012, 9: 265-272.

[17]Lugenbiel P, Thomas D, Kelemen K, et al. Genetic suppression of Galphas protein provides rate control in atrial fibrillation [J]. Basic Res Cardiol. 2012, 107: 265.

[18]Sasano T, McDonald AD, Kikuchi K, et al. Molecular ablation of ventricular tachycardia after myocardial infarction [J]. Nat Med. 2006, 12: 1256-1258.

[19]Amit G, Kikuchi K, Greener ID, et al. Selective molecular potassium channel blockade prevents atrial fibrillation [J]. Circulation. 2010, 121: 2263-2270.

[20]Bunch TJ, Mahapatra S, Bruce GK, et al. Impact of transforming growth factor-beta1 on atrioventricular node conduction modification by injected autologous fibroblasts in the canine heart [J]. Circulation. 2006, 113: 2485-2494.

[21]Chiang DY, Kongchan N, Beavers DL, et al. Loss of microRNA-106b-25 cluster promotes atrial fibrillation by enhancing ryanodine receptor type-2 expression and calcium release [J]. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2014, 7(6): 1214-1222.

[22]Hu S, Wang Z, Polejaeva I. 40 knockout of goat nucleoporin 155 (nup155) gene using crispr/cas9 systems [J]. Reprod Fertil Dev. 2013, 26(1): 134.

[23]Cleland JG, Coletta AP, Buga L, et al. Clinical trials update from the American Heart Association Meeting 2010: EMPHASIS-HF, RAFT, TIM-HF, Tele-HF, ASCEND-HF, ROCKET-AF, and PROTECT[J]. Eur J Heart Fail.2011; 13(4): 460-465.

綜述·進(jìn)展

Use of animal models of atrial fibrillation in the study of

cellular and molecular therapy

HUANG Jia-yuan1,2, WU Jian3,YANG Feng-hua2,4,CHEN Can5

(1. Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China;

2. Guangdong Key Laboratory of Laboratory Animal Sciences, Guangzhou 510663;

3. Zhongshan Hospital Fudan University, Shanghai 200032;

4. Guangdong Laboratory Animal Monitoring Institute, Guangzhou 510663;

5. Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023)

【Abstract】Atrial fibrillation (AF) is an abnormal heart rhythm characterised by rapid and irregular beating. It is caused by multiple factors and can lead to ischemia-associated thrombosis, heart failure and other complex symptoms. Based on the etiology and characteristics of AF, animal models have 3 main categories including electrical, neurohormonal or vessel-related, and structural remodeling models. New technologies such as microRNA knock-down/overexpression or CRISPR-Cas9 gene editing provide tools for constructing animal AF models and directions in the development of AF therapeutic strategies. Currently these strategies have largely focused on the cellular and molecular therapeutics rather than traditional invasive electrophysiological methods or antiarrhythmic drugs. With the aid of new tools, progress has been greatly made in a broad range of therapeutic research areas including molecular mechanisms, drug targeting and screening. This review summarizes the animal models of atrial fibrillation currently used in studies of the molecular and cellular therapeutics and notes their contributions to this research area.

【Key words】Atrial fibrillation; Animal disease model; Cellular and molecular therapy; Molecular mechanisms, diseases

[收稿日期]2015-01-23

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2015.02.019

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847(2015) 02-0205-04

[通訊作者]陳燦,主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師， Email: chencan-21@163.com

[作者簡介]黃家園(1988-),男,碩士研究生,研究方向: 心血管方向, Email: 361985790@qq.com

[基金項(xiàng)目]廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(No.2013061402001);國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No.81200086)。