急性放射性肝損傷大鼠模型的建立與評價

吳戈，肖蕾，張瑞麗，艾尼瓦爾.艾木都拉，張華，毛睿，程緯，王云蓮，楊穎，包永星

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，烏魯木齊　830054)

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急性放射性肝損傷大鼠模型的建立與評價

吳戈，肖蕾，張瑞麗，艾尼瓦爾.艾木都拉，張華，毛睿，程緯，王云蓮，楊穎，包永星*

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，烏魯木齊830054)

【摘要】目的探討急性放射性肝損傷大鼠模型的建立及TGF-β1動態(tài)變化的意義。方法選用雄性SD大鼠40只，隨機分為模型組(30只)和對照組(10只)。除對照組外，模型組大鼠右半肝均接受單次6 MV X線25 Gy照射，接受照射第3、5、10天，應用HE染色、透射電鏡下觀察大鼠右肝病理學變化，血清學檢測TGF-β1、肝功能相關指標(ALT，AST，ALP)，數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。結果在照射第3、5、10天后，電鏡下可觀察肝臟早期病理學改變；TGF-β1的表達隨時間延長而逐漸增加，模型組與對照組比較、不同時間段相比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；對照組和模型組的HE染色結果之間無明顯差別；肝功能相關指標(ALT，AST，ALP)不同時間點比較無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論電鏡下觀察肝臟病理學改變早于光鏡下的變化，可用于早期放射性肝損傷的評價； TGF-β1較肝功能更加敏感地反映出照射后肝臟的損傷狀態(tài)，可作為預測急性放射性肝損傷程度的血清細胞因子。

【關鍵詞】放射性肝損傷；放射性肝纖維化；TGF-β1，大鼠

近年來隨著放療技術的發(fā)展，放療越來越多地應用于中晚期的肝癌患者[1]。然而放射誘導的肝損傷(radiation-induced liver injury，RILI)卻成為制約肝臟放射治療療效的瓶頸。放射性肝損傷又稱放射性肝病(radiation-induced liver disease ,RILD)，是由于肝組織受到一定劑量的放射線照射后，肝細胞發(fā)生一系列生理、病理變化引起肝組織損傷，其損傷程度取決于肝臟受照體積、照射劑量及肝功能狀態(tài)等綜合因素[2]。相關研究表明，RILD是繼發(fā)于腹部腫瘤放射治療最嚴重的、制約肝臟放射治療劑量遞增的致死性并發(fā)癥[3]。因此，對放射性肝損傷的早期防治成為減少晚期肝癌放射治療并發(fā)癥的關鍵。目前對各種肝臟疾病的治療藥物的篩選很大程度上依賴于實驗動物模型的建立和應用，因此，建立較為既安全又完善的動物模型對肝臟疾病的研究有著重要的現(xiàn)實意義[4]。本實驗應用單次25 Gy劑量外照射SD大鼠右肝建立放射性肝損傷模型，分別將對照組及在照射后3、5、10 d對照射后的肝臟組織進行HE染色、透射電鏡檢查，血清中檢測TGF-β1及大鼠肝功能的變化等檢測對SD大鼠急性放射性肝損傷模型進行評價和分析，為放射性肝損傷的基礎實驗研究中模型的建造提供一定的參考，從而為臨床早期放射性肝損傷的防治提供一定研究基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物

清潔級雄性SD大鼠40只，6周齡，體重200～220 g。由新疆醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心提供[SCXK(新)2011-0004]。隨機數(shù)字表法分模型組和對照組，其中，模型組分三組，分別為單次25 Gy劑量外照射右肝后3d組、5d組、10d組，對照組10只。實驗在新疆醫(yī)科大學動物實驗室進行【SYXK(新)2010-0003】，對大鼠的處理符合2006年中國科學技術部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[5]。

1.2主要試劑及儀器

TGF-β1 ELISA試劑盒(BMS623/3, 美國)。瓦里安XIM-CX型模擬定位機、瓦里安2300C/D直線加速器(美國Varian醫(yī)療器械公司)、 日立-H600型透射電鏡等。

1.3實驗方法

1.3.1大鼠放射性肝纖維化模型的建立

本模型的建立參照本課題組前期的實驗方法[6]并加以改進。隨機分組后將氯胺酮、地西泮混合液用生理鹽水以0.75 mL/100 g體重進行腹腔注射麻醉后仰臥位，用自制鼠板固定，瓦里安模擬定位機定位后瓦里安直線加速器下行肝右葉照射。照射野面積為2 cm × 2 cm，其范圍包括：內側界脊柱右側緣，外界開放，上界至膈頂，下界距離上界2 cm。采用6 MV-X線源皮照射技術，源皮距(SSD)100 cm，照射深度在皮下2 cm，吸收劑量率為300 cGy/min，單次照射總量為25 Gy建立實驗模型。

1.3.2觀察指標檢測方法

在照射后3、5、10d隨機抽取模型組大鼠10只、對照組大鼠3～4只，以下以一只大鼠為例來說明檢測方法：(1)光鏡：取大鼠右肝同一部位、同一位置組織，置入4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后3 μm切片，采用蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察大鼠肝組織病理形態(tài)學變化；(2)電鏡：從對照組及各模型組中隨機抽取1只，取非照射及照射后肝臟組織約2.0 mm ×0.5 mm × 0.5 mm，經戊二醛及氧化鋨溶液先后固定，包埋，超薄切片，經電子染色后在透射電鏡下觀察；(3)血清學檢測：麻醉后腹主動脈采血，離心(3000 r/min)10 min后取上清液，放-80℃冰箱保存。使用ELISA法批量檢測血清TGF-β1水平，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書操作；肝功能相關指標ALT，AST，ALP等指標使用全自動生化分析儀檢測大鼠血清。其余大鼠均采用同樣操作方法進行檢測。

1.4統(tǒng)計學處理

2結果

2.1肝臟組織光鏡下變化

大鼠肝臟組織HE染色的觀察結果：對照組大鼠肝組織經HE染色后，肉眼觀察淡粉色，鏡下肝小葉結構完整，可見中央靜脈及放射狀肝細胞索(見圖1a)；模型組大鼠在照射3d后肉眼觀察大體未見明顯變化，鏡下肝細胞腫脹(見圖1b箭頭所指)；在照射5d后, 肝臟大體形態(tài)較正常顏色稍紅，大體肝臟顏色未見明顯變化，可見肝臟細胞腫脹明顯(見圖1c箭頭所指)；在照射后10d，肉眼可見肝臟明顯暗紅，光鏡下可見肝臟細胞水腫，甚至可見明顯脂肪空泡(見圖1d箭頭所指)。由圖可見隨著照射后時間的延長，肝臟損傷逐漸加重。

2.2肝臟組織電鏡下的變化

注：a. 正常肝臟對照組； b. 照射后3 d； c. 照射后5 d； d. 照射后10 d。模型組未見肝臟組織損傷，在觀察范圍內，光鏡下觀察模型組與對照組無明顯差別?！　D1　光鏡觀察放射性肝損傷大鼠肝臟組織變化(×200)Note. a. A normal rat; b. A rat at 3 days after irradiation; c. A rat at 5 days after irradiation; d. A rat at 10 days after irradiation. No significant difference is seen between the samples.　　Fig.1　Histological appearance of liver tissues of rats with radiation-induced liver injury(×200)

注： a. 正常肝臟對照組； b. 照射后3 d, 可見肝細胞輕度水腫，基質密度降低； c. 照射后5 d，可見肝細胞腫脹，滑面內質網增生； d. 照射后10 d，肝細胞明顯腫脹，線粒體普遍水腫，線粒體嵴排列松散?？梢婋S照射后觀察時間的延長，肝損傷程度逐漸加重?！　D2　電鏡觀察放射性肝損傷大鼠肝臟組織變化(×200)Note. a. A normal rat liver. b. A rat liver at 3 days after irradiation; c. A rat liver at 5 days after irradiation; d. A rat liver at 10 days after irradiation. The hepatocyte swelling and mitochondrial damages are progressing along with the time prolongation.　　Fig.2　Ultrastructural changes of the radiation-induced liver injury in the rats(×200)

大鼠肝臟組織電鏡下的觀察可見，滑面內質網擴張成大的囊泡狀，其他正常(圖2a)；肝細胞輕微水腫，基質密度降低，滑面內質網增生，肝細胞間可見膠原纖維。部分線粒體可見損傷后輕度水腫(圖2b)；肝細胞腫脹，滑面內質網增生(圖2c)；肝細胞水腫明顯，細胞基質密度降低，線粒體腫脹，線粒體基質密度降低，嵴排列松散(圖2d)。電鏡下肝損傷的程度隨時間的延長，損傷程度呈逐漸加深趨勢。

2.3血清學檢測

利用血清學檢測肝功能ALT、AST、ALP指標，分別在單次25Gy劑量外照射后不同時間點取血，即在照射后的3、5、10 d模型組大鼠的肝功能較正常對照組無明顯變化，差異無顯著性(P>0.05)；用ELISA檢測血清TGF-β1值，正常對照組中TGF-β1呈較模型組低表達，照射后3、5、10d的TGF-β1的表達值較正常對照組呈明顯增高，即隨觀察時間的延長，血清中TGF-β1的表達逐漸增強，且多組兩兩比較(P<0.05)說明差異有顯著性(見表1)。

3討論

Berthrong等[7]認為肝臟急性損傷效應(又稱急性放射性肝炎)的主要病理學特征表現(xiàn)為肝小葉中央靜脈閉塞性損傷(venous occlusive disease, VOD)，在國內彭瑞云等[8]通過大鼠模型動態(tài)觀察肝臟照射后的病理組織改變，曾提出可分為四期：急性放射性肝炎期、肝纖維化前期、肝纖維化期、肝硬化期。肝臟損傷急性期表現(xiàn)為肝細胞變性、中央靜脈及肝竇充血擴張，而放射性肝損傷晚期則會向肝纖維化、肝硬化轉歸。本研究中，大鼠在單次劑量25 Gy照射后光鏡下觀察雖無病理形態(tài)異常，但從模型組找中隨機抽取一只大鼠進行的肝臟透射檢查中發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的肝臟照射區(qū)已經出現(xiàn)了肝細胞水腫明顯，細胞基質密度降低，線粒體普遍腫脹等肝臟損傷形態(tài)，正常對照組大鼠肝臟未見病理學改變，由電鏡圖(圖2)已可見，模型組中隨觀察時間延長，肝臟損傷程度逐漸加重。這與沈鈞康等[9]研究結果一致，由此說明，在放射性肝損傷早期，電鏡下超微結構變化能更早體現(xiàn)肝臟在輻射誘導后的損傷表現(xiàn)，從而能及早的防治放射性肝損傷的進展。

Tab.1Changes of serum ALT, AST,ALP and TGF-β1of the rats at different time points after 25 Gy X-ray irradiation

組別Groups血清肝功能ALTASTALPTGF-β1值對照組Control96.26±6.4447.22±13.92220.88±49.8022732.2±5507.90照射后3d(3dafterirradiation)97.10±8.4040.06±8.65161.06±51.3242075.06±10449.41*照射后5d(5dafterirradiation)98.76±14.9637.66±5.69161.3±23.9665186.59±9342.61*#照射后10d(10dafterirradiation)84.56±14.6063.13±47.49172.5±51.45104567.62±13005.86*#ΔF值Fvalue0.320.881.5837.53P值Pvalue0.800.470.250.00

注：與對照組(0天)相比，模型組照射后3、5、10 d的肝功能指標ALT、AST、ALP分別進行多組比較后，P﹥0.05說明各組數(shù)值變化差異無顯著性。*與對照組(0天)相比，P<0.05；#與3天模型組相比，P<0.05；△與5天模型組相比，P<0.05，不用時間點的模型組與對照組比較(P<0.05)差異有顯著性，多組兩兩比較(P<0.05)說明差異有顯著性，即隨觀察時間的延長，血清中TGF-β1的表達逐漸增強。

Note. Compared with the control group (0 days), the values of liver function parameters are not significantly changed in the rats after X-ray irradiation (P>0.05).*P<0.05, compared with the control group (0 days);#P<0.05, compared with the model group at 3 days iafter irradiation;△P<0.05, compared with the model group at 5 days after irradiation. The expression of serum TGF-β1 is increasing along with the time prolongation.

Anscher等[10]報道了TGF-β1蛋白水平在遲發(fā)型放射性肝損傷組織中顯著高表達，臨床前期及臨床研究也都顯示了TGF-β1水平和放射誘導的纖維化密切相關。國內學者曾昭沖等[11]首次應用AdT β RII Fc拮抗TGF-β信號通路阻止大鼠肝臟放射性纖維化，也證實了TGF-β是炎癥損傷的關鍵因子這一觀點。本實驗中照射后大鼠血清中TGF-β1水平隨時間增加逐漸升高，各組之間相比較差異有顯著性(P<0.05)，與此同時，相同的時間點血清檢測的模型組大鼠肝功與正常對照組大鼠的相比較，差異無顯著性(P>0.05)，由此說明在放射性肝損傷早期血清學檢測TGF-β1較肝功能更加敏感反映出照射后肝臟的損傷狀態(tài)，可作為預測放射性肝損傷程度的血清細胞因子。

肝損傷屬于放射治療后的早期可逆病變[12]，及時的發(fā)現(xiàn)對于后期的治療并預防并發(fā)癥顯得非常關鍵。本實驗用單次劑量25 Gy右半肝照射SD大鼠，電鏡下觀察肝臟病理學改變早于光鏡下的變化，可用于早期放射性肝損傷的防治與評價；TGF-β1較肝功能更加敏感反映出照射后肝臟的損傷狀態(tài)，有望作為預測急性放射性肝損傷程度的血清細胞因子，從而為放射性肝損傷的防治及后期的臨床研究提供一定的思路。

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研究報告

Establishment and evaluation of a rat model of acute

radioation-induced liver injury

WU Ge, XIAO Lei, ZHANG Rui-li, AN Ni-wa-er.AI mu-du-la, ZHANG Hua, MAO Rui,

CHENG Wei, WANG Yun-lian, YANG Ying, BAO Yong-xing

(Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi Xinjiang 830054, China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the establishment of a rat model of acute radiation-induced liver injury and significance of the dynamic changes of TGF-β1 expression. Methods Forty healthy 6-week old male SD rats were randomly divided into model group (n=30) and control group (n=10). The right liver of rats in the model group was given a single dose of 25 Gy 6 MV X-ray irradiation. Histopathological examination using HE staining and transmission electron microscopy were conducted to observe the liver pathological changes in rats at 3, 5, and 10 days after irradiation, serum TGF-β1 was detected, and relevant indicators of liver function (ALT, AST, ALP) were determined. Statistical analysis was performed using SPSS 17.0 software. ResultsAt 3, 5 and 10 days after irradiation, early pathological changes in the liver cells were observed by electron microscopy, the expression of TGF-β1 was gradually increased with the time prolongation, and significant differences were found between the model group and the control group at different time points (P<0.05). The light microscopic observation of liver tissues did not show significant differences between the control group and model group. The liver ALT, AST, ALP at different time points did not show significant differences between the two groups (P>0.05). Conclusion Electron microscopy can be used to evaluate the early changes of radiation-induced liver injury, prior to the alterations visible by routine light microscopy. TGF-β1 can be used to predict the degree of radiation-induced liver injury, and may be used as a sensitive serum cytokine in predicting the degree of radiation-induced acute liver injury.

【Key words】Radiation-induced liver injury; Radiation-induced hepatic fibrosis; Transforming growth factor β1; Rats.

[收稿日期]2014-10-10

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2015.02.014

【中圖分類號】Q95-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1005-4847(2015) 02-0178-04

[通訊作者]包永星，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，研究方向：惡性腫瘤的綜合治療。E-mail： baoyx@vip.sina.com。

[作者簡介]吳戈，女，碩士研究生，研究方向：惡性腫瘤的綜合治療。E-mail： 272967575@qq.com

[基金項目]新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院院內科研獎勵基金(2012YFY32);烏魯木齊市感染與腫瘤重點實驗室開放課題(WIT-2013-06)。