IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ在脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清及組織中的表達(dá)

殷銀霞，許雅清，李海龍,3，邱家權(quán)，程小麗，明海霞，梁永林，吳玉泓*

(1. 甘肅中醫(yī)學(xué)院，蘭州　730000; 2. 甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，蘭州　730020;

3. 甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實(shí)驗(yàn)室, 蘭州　730000)

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IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ在脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清及組織中的表達(dá)

殷銀霞1, 2，許雅清1，李海龍1,3，邱家權(quán)1，程小麗1，明海霞1，梁永林1，吳玉泓1*

(1. 甘肅中醫(yī)學(xué)院，蘭州730000; 2. 甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，蘭州730020;

3. 甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實(shí)驗(yàn)室, 蘭州730000)

【摘要】目的通過(guò)對(duì)脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎(UC)模型大鼠血清及結(jié)腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ表達(dá)水平的檢測(cè)，探討它們?cè)赨C發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。方法采用灌服大黃水煎液+肌肉注射氫化可的松并結(jié)合TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)+ 乙醇灌腸建立脾腎陽(yáng)虛型UC動(dòng)物模型。將60只大鼠隨機(jī)分為空白組、脾腎陽(yáng)虛型UC模型7、14d及21d組，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)各組大鼠血清及結(jié)腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ的含量。結(jié)果與空白組比較，脾腎陽(yáng)虛型UC模型組大鼠血清及結(jié)腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ含量明顯升高(P<0.05)；尤以模型21d組最為明顯。結(jié)論促炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ在脾腎陽(yáng)虛型UC發(fā)病過(guò)程中起重要作用。

【關(guān)鍵詞】潰瘍性結(jié)腸炎；脾腎陽(yáng)虛；白細(xì)胞介素；腫瘤壞死因子-α；干擾素-γ；大鼠

Expression and significance of IL-1, IL-6, TNF-α and IFN-γ

in serum and colon tissue in the rat models of ulcerative colitis

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種結(jié)腸黏膜及黏膜下的慢性炎性反應(yīng)，臨床以腹痛、腹瀉、黏液膿血便及里急后重為主要表現(xiàn)，近年來(lái)國(guó)內(nèi)患病人數(shù)日漸增多，成為常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病[1]。UC的確切病因和發(fā)病機(jī)制迄今未明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，可能是遺傳、環(huán)境和免疫等多因素共同作用的結(jié)果,細(xì)胞因子失衡又是UC產(chǎn)生腸道非特異性炎性反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),而且目前促炎細(xì)胞因子及抑炎細(xì)胞因子失衡機(jī)制也越來(lái)越受到人們的重視[2]。國(guó)內(nèi)學(xué)者王天芳等[3]通過(guò)系統(tǒng)檢索評(píng)價(jià)各數(shù)據(jù)庫(kù)文獻(xiàn)對(duì)UC中醫(yī)證候進(jìn)行整理，結(jié)果提示脾腎陽(yáng)虛型UC發(fā)生率位居UC各類(lèi)型證候之首[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酶聯(lián)免疫法來(lái)研究促炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ與潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)系，闡明它們?cè)谄⒛I陽(yáng)虛型UC發(fā)病中的作用。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠60只，體重(180±10)g，雌雄各半，雄鼠鼠齡為40日齡左右，雌鼠鼠齡為45日齡左右。由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(甘)2011-0001-00013】。動(dòng)物飼養(yǎng)在甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室【SYXK(甘)2011-0001-00013】，飼養(yǎng)動(dòng)物所需的籠具及飲水瓶均由以上實(shí)驗(yàn)室經(jīng)高壓滅菌后提供。

1.2藥品、試劑及主要儀器

三硝基苯磺酸(TNBS，購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)111M5001V)；氫化可的松注射液(批號(hào)13060211)；白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)Elisa試劑盒(批號(hào)20140301A)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

大黃水煎液制備：大黃中藥材(購(gòu)自甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房)，常規(guī)水煎后，按13.5 g(生藥)/kg體質(zhì)量計(jì)量濃縮到濃度為1.35 g/mL。

1.3主要儀器

Benchmark Plus連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad)，高速冷凍離心機(jī)(Biofuge-Stratos)，水浴鍋(DZKW-4型)，勻漿器。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1分組與造模

在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室(室溫在21～27℃)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將60只大鼠按體重及雌雄用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組15只。脾腎陽(yáng)虛型模型參考文獻(xiàn)方法[5-6]。第一階段復(fù)制脾虛模型：上午灌服大黃水煎液，每只2 mL/d,下午灌服蒸餾水每只2 mL/d，連續(xù)14 d；第二階段在脾虛基礎(chǔ)上繼續(xù)復(fù)制脾腎陽(yáng)虛模型：第15 天在大鼠左右肢臀部交替注射肌肉注射氫化可的松25 mg/(kg·d)，并灌服蒸餾水2 mL/d，連續(xù)10 d。第25天禁食不禁水，第26 天用100 mg/kgTNBS加50 %乙醇0.25 mL混合試劑灌腸，復(fù)合法建立脾腎陽(yáng)虛型UC大鼠模型。

2.2標(biāo)本采集及處理

空白組于造模21 d末，脾腎陽(yáng)虛型UC模型組于造模7、14、21 d末采集血清/結(jié)腸組織，水合氯醛麻醉采血后安樂(lè)死并制備待檢標(biāo)本。血清制備：股動(dòng)脈取血，3000 r/min離心10 min，取血清置4℃冰箱保存，待測(cè)。結(jié)腸組織勻漿制備：截取結(jié)腸病變處，沖洗、稱(chēng)重后用眼科剪剪碎，加9倍生理鹽水勻漿，以12,000 r/min 離心10 min，將上清分裝置4℃冰箱保存，待測(cè)。ELISA法檢測(cè)血清及結(jié)腸組織IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ含量，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3結(jié)果

3.1各組大鼠一般生存狀況

空白組大鼠始終表現(xiàn)為反應(yīng)靈敏，活動(dòng)及飲食量正常，毛發(fā)濃密柔順而有光澤，糞便呈棕褐色顆粒狀。脾腎陽(yáng)虛型UC大鼠模型組多數(shù)在第3天后天開(kāi)始出現(xiàn)蜷臥、瞇眼等部分癥狀，第9天后癥狀開(kāi)始明顯，大鼠蜷臥扎堆，食量減少，體重開(kāi)始減輕，便形質(zhì)軟，部分動(dòng)物瞇眼弓背，游泳耐力下降。往后動(dòng)物癥狀逐漸加重，體重明顯減輕，便形稀溏，肛周污穢，少食怠動(dòng)，畏寒，成群蜷縮或弓背，毛發(fā)失去光澤而枯槁疏散等脾腎陽(yáng)虛癥狀。第16天后部分大鼠癥狀有稍微減輕，其余大鼠癥狀仍然嚴(yán)重。

3.2各組大鼠血清和結(jié)腸組織中IL-1含量比較

見(jiàn)表1，結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠血清和結(jié)腸組織中IL-1含量明顯升高(P<0.05)，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中以模型21d組升高最為明顯。

Tab.1Comparison of the levels of IL-1 in serum and colon tissue of the rats.

組別Groups血清IL-1SerumIL-1結(jié)腸IL-1ColontissueIL-1空白組Blankcontrolgroup7.274±8.8117.139±5.005模型7d組Modelgroup,7days8.202±9.029▲9.800±5.910▲模型14天組Modelgroup,14days9.082±8.312▲10.155±8.432▲模型21天組Modelgroup,21days9.712±6.589▲11.820±8.491▲▲

注：與空白組比較，▲P<0.05?！鳳<0.01，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中模型7d組、14d組和21d組分別死亡1只、1只和2只，故檢測(cè)時(shí)每組都統(tǒng)一選取10只，下同。

Note. Compared with the blank group,▲P<0.05.▲▲P<0.01，one rat in the model groups died at days 7, 14 and 21days, respectively, during the experiment. So that 10 rats were selected in each group. The notes are the same below.

3.3各組大鼠血清和結(jié)腸組織中IL-6含量比較

見(jiàn)表2, 結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠血清及結(jié)腸組織中IL-6含量明顯升高(P<0.05)，差異有顯著性。尤以模型21 d組最為明顯。

Tab.2Comparison of IL-6 levels in the serum and colon tissue of the rats.

組別Groups血清IL-6SerumIL-6結(jié)腸IL-6ColontissueIL-6空白組Blankcontrolgroup5.997±0.0976.315±7.554模型7天組Modelgroup,7days6.279±2.790▲8.852±5.896▲模型14天組Mdelgroup,14days7.432±1.146▲9.142±8.020▲模型21天組Modelgroup,21days8.132±3.567▲▲10.895±8.644▲▲

3.4各組大鼠血清和結(jié)腸組織中TNF-α含量比較

見(jiàn)表3, 結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠血清和結(jié)腸組織中TNF-α含量明顯升高(P<0.05)，差異有顯著性，其中尤以模型21 d組升高最為明顯。

Tab.3Comparison of TNF-α levels in serum and colon tissue of the rats.

組別Groups血清TNF-αSerumTNF-α結(jié)腸TNF-αColontissueTNF-α空白組Blankcontrolgroup1.775±3.4941.967±7.292模型7天組Modelgroup,7days1.945±3.660▲2.363±7.713▲模型14天組Modelgroup,14days2.071±7.594▲▲2.697±8.447▲模型21天組Modelgroup,21days2.187±7.627▲3.112±7.728▲▲

3.5各組大鼠血清和結(jié)腸組織中IFN-γ含量比較

表4實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠血清和結(jié)腸組織中IFN-γ含量明顯升高(P<0.05)，差異有顯著性，其中模型21d組最為明顯。

Tab.4Comparison of IFN-γ levels in serum and colon tissue of the rats.

組別Groups血清IFN-γSerumIFN-γ結(jié)腸IFN-γColontissueIFN-γ空白組Blankcontrolgroup5.437±1.6617.183±2.672模型7天組Modelgroup,7days6.218±1.924▲8.640±2.364▲模型14天組Modelgroup,14days6.954±1.080★△8.984±1.892★△模型21天組Modelgroup,21days7.159±5.053★△9.656±1.614★△

4討論

UC又稱(chēng)為非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，被認(rèn)為是結(jié)腸癌癌前病變[7]，炎性腸病在西方國(guó)家相當(dāng)常見(jiàn)，國(guó)內(nèi)近10年亦呈上升趨勢(shì)。與UC關(guān)系密切的促炎因子主要有IL-1、IL-6、TNF-a、IFN-r等，在UC的組織破壞及炎性反應(yīng)中起著重要作用[8]。

其中IL-1是一種多肽類(lèi)細(xì)胞因子, 主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,在炎癥和免疫反應(yīng)中它是一個(gè)關(guān)鍵的介質(zhì)。IL-1通過(guò)免疫上調(diào)(激活T細(xì)胞和B細(xì)胞、促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、促進(jìn)IL-2受體表達(dá)、和其他細(xì)胞因子協(xié)同作用、促進(jìn)其他細(xì)胞因子表達(dá)) 和促進(jìn)炎癥活性(促使中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化及脫顆粒、促進(jìn)炎癥細(xì)胞釋放前列腺素、血栓素、血小板活化因子等、增加上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的通透性)而發(fā)揮作用。文獻(xiàn)[9]報(bào)道活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎患者病變黏膜組織以及從中分離出的固有層單核細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1較對(duì)照組明顯增高。在本研究中，通過(guò)檢測(cè)血清和組織中IL-1的含量，進(jìn)而加以分析，也證實(shí)了在UC中該炎癥因子確實(shí)是呈增高趨勢(shì)，并且隨著時(shí)間的推移，炎癥越發(fā)嚴(yán)重。

IL-6是一種作用廣泛的促炎性因子，其促炎性作用包括：(1)促進(jìn)B細(xì)胞活化、增生并最終分化為漿細(xì)胞，增加免疫球蛋白合成；(2)促進(jìn)T細(xì)胞增殖、刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)；(3)激活G0期造血干細(xì)胞進(jìn)入G1 期，使粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖；(4)在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)肝細(xì)胞生成急性期蛋白。一系列研究發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎患者血清IL-6濃度明顯升高，且與病變范圍和病變嚴(yán)重程度成正相關(guān)[10]。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)不難看出IL-6在UC中表達(dá)明顯。

TNF-α和IFN-γ也是兩種在炎癥過(guò)程中有很重要作用的炎癥因子，比如TNF-α主要由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，主要以旁分泌和自分泌的方式在腸黏膜局部發(fā)揮作用。TNF-α具有上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子ELAM-1、ICAM-1、VCAM-a的表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生血小板活化因子和趨化性細(xì)胞因子IL-8的功能[11]。這些因素導(dǎo)致循環(huán)中中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞等與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，進(jìn)而遷移和外滲至局部組織，引起炎性反應(yīng)。而IFN-γ是一種二聚體糖蛋白，由Thl淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，它的免疫調(diào)節(jié)活性強(qiáng)，是強(qiáng)有力的吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞激活物[12]，在炎癥反應(yīng)中也參與調(diào)節(jié),我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠不同時(shí)期大腸黏膜中IFN-γ等這些促炎因子表達(dá)量都有所增加，明顯高于空白組，由此可以認(rèn)為在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過(guò)程中IFN-γ、TNF-α等都起著很重要的作用，可能加重腸黏膜炎癥以及腸黏膜上皮細(xì)胞的凋亡等。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脾腎陽(yáng)虛型UC模型組大鼠血清及結(jié)腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ的含量與空白組相比較明顯升高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，炎癥越發(fā)嚴(yán)重。如上所述，促炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ通過(guò)免疫上調(diào)和促進(jìn)炎癥活性而加重腸道黏膜的炎性反應(yīng)和組織損傷，在大鼠UC模型的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起重要作用。

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研究報(bào)告

with spleen and kidney yang deficiency

YIN Yin-xia1,2, XU Ya-qing1, LI Hai-long1,3, QIU Jia-quan1, CHENG Xiao-li1,

MING Hai-xia1, LIANG Yong-lin1, WU Yu-hong1*

(1.Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000,China;

2. Gansu College of Traditional Chinese Medicine Hospital, Lanzhou 730020;

3. Gansu Province Chinese Medicine Engineering Laboratory of New Products, Lanzhou 730000)

【Abstract】ObjectiveTo detect the levels of IL-1, IL-6,TNF-α and IFN-γ in serum and colon tissue of rat models of ulcerative colitis with spleen and kidney Yang deficiency, and to explore their roles in the pathogenesis of ulcerative colitis (UC). Methods The rat model of ulcerative colitis with Yang deficiency of spleen and kidney was induced by perfusion of rhubarb decoction plus intramuscular injection of hydrocortisone and combined with TNBS (2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) and ethanol enema. Sixty SPF wistar rats (body weight 180±10 g, male:female=1:1) were randomly divided into blank control group, UC model with spleen kidney Yang deficiency for 7 days, 14 days and 21 days groups, respectively. The levels of IL-1, IL-6, TNF-α and IFN-γ in serum and colon tissue were detected by ELISA. ResultsCompared with the blank group, the levels of IL-1, IL-6, TNF-α and IFN-γ in serum and colon tissue of rat UC model group with spleen kidney Yang deficiency were greatly increased (P<0.05), especially evidently increased in the model group at 21 days. ConclusionsThe pro-inflammatory cytokines IL-1, IL-6, TNF-α and IFN-γ play an important role in the pathogenesis of ulcerative colitis with syndrome of spleen and kidney Yang deficiency.

【Key words】Ulcerative colitis; Yang deficiency of spleen and kidney; Interleukin; Tumor necrosis factor alpha; Interferon gamma; Enzyme linked immunosorbent assay; Rat

[收稿日期]2014-10-27

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2015.02.007

【中圖分類(lèi)號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847(2015) 02-0139-04

[通訊作者]吳玉泓，男，博士，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)病證結(jié)合動(dòng)物模型及治則治法研究。Email： yhw67@126.com

[作者簡(jiǎn)介]殷銀霞(1968-)，女，專(zhuān)業(yè)：老年病及呼吸病，研究方向：中醫(yī)治則治法研究。

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260520)。