麝香保心丸對(duì)心力衰竭大鼠心肌重構(gòu)及縫隙連接蛋白Cx43和Cx45的影響

吳志雄， 江振濤， 羅 健， 周松柏， 肖 婷， 李 芳， 楊 軍

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南衡陽(yáng)421001）

麝香保心丸對(duì)心力衰竭大鼠心肌重構(gòu)及縫隙連接蛋白Cx43和Cx45的影響

吳志雄， 江振濤， 羅 健， 周松柏， 肖 婷， 李 芳， 楊 軍*

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南衡陽(yáng)421001）

目的觀察麝香保心丸（Shexiang Baoxin Pills，SBP）對(duì)壓力超負(fù)荷所致心力衰竭大鼠的心肌重構(gòu)及縫隙連接蛋白Cx43和Cx45表達(dá)的影響。方法取雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為假手術(shù)組 （SO組）、心力衰竭模型組 （HF組）、心力衰竭模型+麝香保心丸組 （HS組），各10只。采用腹主動(dòng)脈縮窄法建立大鼠心力衰竭模型，HS組以麝香保心丸 （15mg/kg，1天2次）灌胃，而HF組和SO組則用生理鹽水替代。12周后進(jìn)行心臟B超檢查，處死大鼠，取出左心室肌組織，HE染色觀察心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)，Western blot檢測(cè)Cx43和Cx45在左室心肌組織的表達(dá)。結(jié)果心臟B超顯示，與SO組比較，HF組左室舒張末內(nèi)徑顯著增加，EF（射血分?jǐn)?shù)）值下降；HS組左室舒張末內(nèi)徑減少，EF值增加。HE染色顯示，HS組與HF組相比，心肌細(xì)胞排列紊亂明顯改善；Western blot顯示，HF組Cx43表達(dá)明顯減少，但Cx45表達(dá)沒有明顯變化；HS組Cx43表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)論SBP可以改善心力衰竭大鼠的心肌重構(gòu)，改善縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的下調(diào)。

麝香保心丸；心肌細(xì)胞；Cx43；Cx45；心肌重構(gòu)

心力衰竭是大多數(shù)心血管疾病的終末期表現(xiàn)和主要死因。心肌重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本病理機(jī)制，心肌重構(gòu)不僅引起心功能障礙，而且是各種心律失常發(fā)生的基質(zhì)，所以心力衰竭時(shí)更容易并發(fā)心律失常和猝死。縫隙連接重構(gòu)不僅與心力衰竭時(shí)的結(jié)構(gòu)重構(gòu)密切相關(guān)，也是心力衰竭時(shí)電生理重構(gòu)的重要組成部分?？p隙連接 （gap junc-tion，GJ）是相鄰心肌細(xì)胞間電化學(xué)偶聯(lián)的通道，其中Cx43是心室肌表達(dá)的最主要縫隙連接蛋白 （Connexin，Cx）［1］，而心室肌內(nèi)同時(shí)還存在Cx45?？p隙連接蛋白表達(dá)的異常可能影響縫隙連接電荷耦聯(lián)和代謝耦聯(lián)的功能導(dǎo)致心律失常的發(fā)生。麝香保心丸已證實(shí)具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)血管新生及抗心肌纖維化等作用［2］。臨床上也發(fā)現(xiàn)麝香保心丸對(duì)早搏、房顫、慢性心律失常也具有一定的療效［3］，但是針對(duì)其作用機(jī)制目前少有研究，而麝香保心丸與縫隙連接重構(gòu)關(guān)系目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過腹主動(dòng)脈縮窄大鼠模型觀察麝香保心丸對(duì)壓力超負(fù)荷所致心力衰竭時(shí)心肌重構(gòu)及心室肌縫隙連接重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 麝香保心丸由上海和黃藥業(yè)提供；Cx43一抗、DAD顯色試劑盒、免疫組化染色試劑盒均購(gòu)于博士德公司；HE染色試劑盒購(gòu)于北京碧云天生物技術(shù)公司；石蠟切片機(jī)、烤片機(jī)、自動(dòng)脫水機(jī)均購(gòu)于德國(guó)Leica公司；-80℃低溫冰箱購(gòu)于日本SANYO公司；冷凍離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；心臟彩色B超機(jī)購(gòu)于美國(guó)GE公司；垂直電泳儀器及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)為中國(guó)北京六一儀器廠生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)大鼠 成年雄性SD大鼠（Sprague-Dawley）30只，體質(zhì)量200～250 g，南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（湘）2010-0006。

1.3 壓力超負(fù)荷心力衰竭模型的制備 將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組 （SO組），心力衰竭模型組 （HF組）、心力衰竭模型+麝香保心丸組 （HS組），每組10只，均用10%的水合氯醛 （3 mL/kg）腹腔注射麻醉，固定，備皮，常規(guī)消毒后，沿腹正中線作一長(zhǎng)約2 cm切口，分離組織，打開腹腔，HF組和HS組大鼠在腎動(dòng)脈上方找到腹主動(dòng)脈，然后用4號(hào)手術(shù)縫線將一個(gè)直徑為0.7 mm的針頭與腹主動(dòng)脈一起結(jié)扎，隨后取出該鋼針，從而形成腹主動(dòng)脈縮窄，驗(yàn)證腹主動(dòng)脈通暢后，注入慶大霉素注射液預(yù)防感染，快速分層縫合關(guān)閉腹腔［4］。SO組大鼠除了不縮窄腹主動(dòng)脈外其余步驟完全與上述相同。HS組通過灌胃的方法每天給予SBP 15 mg/kg（溶于雙蒸水2 mL）灌胃2次，而SO組和HF組則用自來水灌胃［5］。常規(guī)喂養(yǎng)12周。

1.4 超聲檢測(cè)心動(dòng)圖 麝香保心丸干預(yù)12周后，麻醉大鼠，固定，剃胸前區(qū)毛，取仰臥位，由有經(jīng)驗(yàn)的心臟超聲醫(yī)生用彩色多普勒超聲診斷儀盲法測(cè)量，測(cè)量左室收縮期內(nèi)徑（Left ventricular systolic diameter，LVIDs），左室舒張期內(nèi)徑（Left ventricular diastolic diameter，LVIDd），射血分?jǐn)?shù)（Ejection fraction，EF）。

1.5 HE心肌組織染色觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 處死大鼠后，縱向切取小塊左心室心肌組織，置10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，最后樹膠封片。鏡下觀察：細(xì)胞核深藍(lán)色，胞漿及纖維組織呈深淺不等的紅色。

1.6 Western blot測(cè)定麝香保心丸對(duì)心衰模型大鼠心肌Cx43和Cx45表達(dá)的影響 取小塊左心室心肌組織剪成100 mg左右大小組織塊，用于提取蛋白。以BCA蛋白定量試劑盒定量各組蛋白濃度。采用10%SDS-PAGE凝膠電泳，充分分離目的蛋白；將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；將膜置于封閉液中于室溫下?lián)u床孵育2 h。封閉結(jié)束后，分別孵育兔抗大鼠Cx43和Cx45多克隆抗體 （1∶1 000），4℃過夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，以封閉液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶2 000），室溫?fù)u動(dòng)孵育1 h。TBST緩沖液洗膜。將DAD顯色試劑盒中的A和B兩種試劑在避光的離心管中等體積混勻1 min，將此混合液均勻圖于膜蛋白上，置于顯影儀上曝光顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件及EXCEL分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析，檢驗(yàn)方差齊性，方差齊性的兩兩進(jìn)行組間比較，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況 造模過程中，假手術(shù)組和心力衰竭組各死亡1只，可能死于麻醉意外和手術(shù)大出血。28只大鼠完成實(shí)驗(yàn)，其中SO組9只，HF組9只，HS組10只。

2.2 建模12周后各組大鼠的左室內(nèi)徑及EF值測(cè)量結(jié)果

與SO組相比，HF組和HS組大鼠心臟左室收縮期內(nèi)徑LVIDs，左室舒張期內(nèi)徑LVIDd明顯增大，EF值下降均小于50%，與HF組相比，HS組大鼠心臟左室收縮期內(nèi)徑LVIDs和左室舒張期內(nèi)徑LVIDd減少，EF值增加，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），結(jié)果見表1和圖1。

表1 麝香保心丸對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄SD大鼠心臟B超參數(shù)的影響 （x±s）

2.3 HE染色觀察麝香保心丸對(duì)心力衰竭大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的影響 圖2中HE染色顯示SO組心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，心肌細(xì)胞排列規(guī)則；HF組心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞肥大，心肌細(xì)胞間隙增寬，間質(zhì)可見纖維化；而用麝香保心丸干預(yù)的HS組，心肌細(xì)胞排列較規(guī)則，大部分心肌纖維呈平行排列，結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)有少量疏松結(jié)締組織。

2.4 麝香保心丸對(duì)心力衰竭大鼠心肌組織Cx43和Cx45表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示：與SO組比較，HF組Cx43的表達(dá)顯著減少 （P＜0.05）；與HF組比較，HS組Cx43的表達(dá)顯著增加，SBP能夠明顯抑制心衰大鼠心肌Cx43表達(dá)的下調(diào) （P＜0.05），見圖3；與SO組比較，HF組Cx45的表達(dá)未明顯變化 （P＞0.05）；而與HF組比較，HS組Cx45的表達(dá)也無明顯改變 （P＞0.05），見圖4。

圖1 各組大鼠M型超聲心動(dòng)圖結(jié)構(gòu)參數(shù)變化

圖2 心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變

圖3 SBP對(duì)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)的影響

圖4 SBP對(duì)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞Cx45表達(dá)的影響

3 討論

心力衰竭是大多數(shù)心血管疾病的終末期表現(xiàn)及主要死亡原因，正在成為本世紀(jì)最重要的心血管疾病，而心肌重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本病理機(jī)制。心肌重構(gòu)的病理主要表現(xiàn)包括心肌細(xì)胞肥大和凋亡，以及胞外基質(zhì)纖維化。人們已發(fā)現(xiàn)心力衰竭時(shí)更容易并發(fā)心律失常和心源性猝死，而這與心肌重構(gòu)時(shí)伴隨的電生理重構(gòu)有關(guān)。電生理重構(gòu)包括離子通道重構(gòu)和縫隙連接［6］。心力衰竭時(shí)發(fā)生的縫隙連接重構(gòu)與心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)密切相關(guān)，故開發(fā)能同時(shí)逆轉(zhuǎn)心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)及縫隙連接重構(gòu)的藥物，對(duì)治療心力衰竭以及其合并的心律失常有著重要價(jià)值。

縫隙連接由縫隙連接蛋白組成，在心室肌細(xì)胞中主要有Cx43、Cx45、Cx40表達(dá)，其中Cx43是心室的主要縫隙連接蛋白?？p隙連接蛋白的表達(dá)異常，可導(dǎo)致細(xì)胞間電化學(xué)偶聯(lián)的異常，從而可促使心律失常發(fā)生。Gutstein等［7］發(fā)現(xiàn)解剖Cx43基因剔除的純合子鼠均因自發(fā)性室性心律失常而猝死。Hall等在擴(kuò)張性心肌病幼鼠模型中發(fā)現(xiàn)在射血分?jǐn)?shù)明顯下降和明顯左室重構(gòu)之前就出現(xiàn)了Cx43表達(dá)的下調(diào)。提示Cx43的重構(gòu)在心力衰竭的早期即可出現(xiàn)，同時(shí)在心力衰竭不同階段可能存在表達(dá)差異［8］。本研究中發(fā)現(xiàn)腹主動(dòng)脈縮窄構(gòu)建的心力衰竭大鼠心臟左室組織中的Cx43表達(dá)明顯的下調(diào)，但Cx45表達(dá)未發(fā)生明顯變化。

麝香保心丸在臨床中主要用于冠心病的治療，但近些年來有研究發(fā)現(xiàn)麝香保心丸對(duì)心衰治療有效。在老年退行性心瓣膜病并發(fā)左心衰竭患者中，給予常規(guī)治療同時(shí)加服麝香保心丸，患者心功能較常規(guī)治療組明顯改善［9］；在心肌梗死后心力衰竭患者也得到類似結(jié)果［10］，但其中機(jī)制不明確。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸可降低大鼠左室舒張期內(nèi)徑LVIDd，增加EF值，同時(shí)觀察心肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比，心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，而麝香保心丸組心肌細(xì)胞排列紊亂明顯改善，提示麝香保心丸麝香保心丸可以改善心功能，其機(jī)制可能與其逆轉(zhuǎn)心力衰竭時(shí)的心肌重構(gòu)有關(guān)。已有多個(gè)臨床觀察研究發(fā)現(xiàn)麝香保心丸對(duì)早搏、房顫、慢性心律失常都有一定的療效，但麝香保心丸減少心律失常的機(jī)制少有研究，與縫隙連接重構(gòu)的關(guān)系也未見報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心力衰竭大鼠心肌Cx43表達(dá)明顯下調(diào)，而麝香保心丸可以上調(diào)心力衰竭大鼠心肌Cx43的表達(dá)，但對(duì)心肌Cx45表達(dá)沒有明顯影響。縫隙連接重構(gòu)與心律失常的發(fā)生和心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)均有關(guān)，麝香保心丸可能具有通過抑制負(fù)性心肌重塑改善心力衰竭時(shí)心肌的縫隙連接重構(gòu)從而減少心律失常的發(fā)生。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為探討中藥的抗心律失常的機(jī)制提供了新的思路。

［1］Itoh M，Takeishi Y，Nakada S，et al.Long-term treatmentwith angiotensin II type 1 receptor antagonist，CV-11974，restores beta-catenin mRNA expression in volume-overloaded rabbit hearts［J］.Heart Vessels，2002，17（1）：36-41.

［2］黃紅漫，許其倓.麝香保心丸對(duì)慢性心力衰竭患者內(nèi)皮功能及心功能的影響［J］.中成藥，2004，26（Z1）：41-43.

［3］張力群，謝 娟，張惠群.麝香保心丸抗動(dòng)物心肌缺血及心律失常的機(jī)理探討［J］.中成藥，2004，26（Z1）：27-29.

［4］高 妍，高建平.心力衰竭動(dòng)物模型的研究進(jìn)展［J］.中成藥，2014，36（01）：148-152.

［5］王大英，李 勇，范維琥.麝香保心丸對(duì)心肌梗死大鼠梗死面積和血管新生的作用［J］.中成藥，2004，26（11）：912-915.

［6］Van Rijen H V，Eckardt D，Degen J，et al.Slow conduction and enhanced anisotropy increase the propensity for ventricular tachyarrhythmias in adultmicewith induced deletion of connexin43［J］.Circulation，2004，109（8）：1048-1055.

［7］Gutstein D E，Morley GE，Tamaddon H，etal.Conduction slowing and sudden arrhythmic death inmicewith cardiac-restricted inactivation of connexin43［J］.Cir Res，2001，88（3）：333-339.

［8］Hall D G，Morley GE，Vaidya D，etal.Early onsetheart failure in transgenic mice with dilated cardiomyopathy［J］.Pediat Res，2000，48（1）：36-42.

［9］徐曉紅.麝香保心丸對(duì)老年退行性心臟瓣膜病左心功能不全的治療作用［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（03）：451-452.

［10］楊國(guó)亮，楊錫珍，劉建輝，等.麝香保心丸對(duì)急性心肌梗死后左室重構(gòu)及心功能影響的超聲觀察［J］.河南中醫(yī)，2014，34（1）：58-59.

R285.5

：B

：1001-1528（2015）06-1329-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.038

2014-08-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81270181）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （11JJ2046）

吳志雄 （1988—），男，碩士，從事心血管疾病研究。Tel：15211803302，E-mail：455247958@qq.com

*通信作者：楊 軍（1972—），男，博士，副教授，副主任醫(yī)師，從事心血管疾病研究。E-mail：yangjunincn@163.com