風(fēng)梅顆粒中齊墩果酸、熊果酸、二羥基澤蘭素和腺苷的測定

伍婉媚， 張 超

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510182；2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東廣州510623）

風(fēng)梅顆粒中齊墩果酸、熊果酸、二羥基澤蘭素和腺苷的測定

伍婉媚1，2， 張 超1*

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510182；2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東廣州510623）

目的建立測定風(fēng)梅顆粒 （東風(fēng)桔、崗梅、枇杷葉、山白芷、廣東土牛膝、紫蘇梗、薄荷腦）中齊墩果酸、熊果酸、二羥基澤蘭素和腺苷的方法。方法采用高效液相色譜法。測定齊墩果酸和熊果酸的色譜柱為Agela venusil XBP-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.05 mol/L醋酸銨溶液 （88∶12）；柱溫為室溫；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20μL；檢測波長為215 nm。測定二羥基澤蘭素和腺苷的色譜柱為Diamonsil C18（4.6 mm×250mm，5μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為0～20 min時(shí)260 nm，20～60 min時(shí)240 nm。結(jié)果齊墩果酸和熊果酸線性范圍分別為2.5～15μg、5～30μg（r≥0.999 0）；平均回收率分別為100.6%和100.4%。二羥基澤蘭素和腺苷線性范圍分別為1.05×10-2～6.3×10-2μg、0.101～0.606μg（r≥0.999 0）；平均回收率分別為101.0%、100.3%。結(jié)論該方法可用于風(fēng)梅顆粒中齊墩果酸和熊果酸、二羥基澤蘭素和腺苷的定量測定，準(zhǔn)確可靠。

風(fēng)梅顆粒；齊墩果酸；熊果酸；二羥基澤蘭素；腺苷

風(fēng)梅顆粒由東風(fēng)桔、崗梅、枇杷葉、山白芷、廣東土牛膝、紫蘇梗、薄荷腦7味中藥組成，功效鎮(zhèn)咳祛痰，用于治療傷風(fēng)感冒，支氣管炎等引起的咳嗽，被收載于 《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》內(nèi)科肺系 （二）分冊(cè)，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)WS-11423（ZD-1423）-2002［1］。但原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)東風(fēng)桔和枇杷葉進(jìn)行了簡單的顯色鑒別，未對(duì)處方中其他藥材進(jìn)行控制。為進(jìn)一步提高風(fēng)梅顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，確保用藥安全可控，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)其中用量較大的枇杷葉和廣東土牛膝的主要成分齊墩果酸、熊果酸、二羥基澤蘭素和腺苷進(jìn)行測定方法研究。

1 試藥與儀器

LC-20ATVP型高效液相色譜儀、SPD-20AVP型紫外可見檢測器 （日本島津公司），HW-2000色譜工作站 （南京千譜軟件有限公司）。齊墩果酸 （純度98%，批號(hào)110709-201205）、熊果酸 （純度98%，批號(hào)110742-201218）、二羥基澤蘭素 （純度97%，批號(hào)2012081）、腺苷 （純度99%，批號(hào)2012018）對(duì)照品，均購于上海江萊生物科技有限公司；風(fēng)梅顆粒 （自制，每袋裝10g，批號(hào)分別為20130615、20130616、20130617）；甲醇、乙腈 （色譜純，上海江萊生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 齊墩果酸和熊果酸的測定［2-9］

2.1.1 對(duì)照品混合溶液制備 精密稱取齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品適量，甲醇溶解，搖勻，即得對(duì)照品混合溶液 （齊墩果酸質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，熊果酸質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL）。

2.1.2 供試品溶液配制 精密稱定本品5.0 g，研細(xì)，置于具塞錐形瓶中，甲醇10 mL溶解，超聲處理 （300 W，25 kHz）30 min，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜 （0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性供試品溶液配制 按風(fēng)梅顆粒處方和工藝，制備不含枇杷葉的陰性樣品和陰性供試品溶液。

2.1.4 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 Agela venusil XBP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.05 mol/L醋酸銨溶液 （88∶12）；柱溫為室溫；體積流量 1.0 mL/min；進(jìn)樣量20μL；檢測波長為215 nm。在此條件下，齊墩果酸和熊果酸與其他組分分離效果良好，且陰性樣品無干擾。另外，以齊墩果酸和熊果酸計(jì)，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于2 500，分離結(jié)果見圖1。

圖1 齊墩果酸和熊果酸的HPLC

2.1.5 線性范圍考察 精密吸取對(duì)照品混合溶液5、10、15、20、25、30μL，按 “2.1.4”項(xiàng)下色譜條件測定，以峰面積積分值 （Y）為縱坐標(biāo)，齊墩果酸和熊果酸量 （X）為橫坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。齊墩果酸為Y=2.187 4X+1.080，r=0.999 2，線性范圍2.5～15μg；熊果酸為Y=1.025 1X+2.007 9，r=0.999 5，線性范圍5～30μg。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取 “2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按 “2.1.4”項(xiàng)下色譜條件，測定齊墩果酸和熊果酸的峰面積，兩者RSD分別為0.3%和0.7%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取批號(hào)為20130615的樣品，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別測定齊墩果酸和熊果酸的峰面積，兩者RSD分別為0.5%和0.3%，表明重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取批號(hào)為20130615的樣品，于0、1、2、4、6、8 h測定齊墩果酸和熊果酸的峰面積，兩者RSD分別為0.5%、0.5%，表明供試品溶液8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率 分別稱取批號(hào)為20130615的含有量已知的樣品（齊墩果酸9.66 mg/袋，熊果酸17.68 mg/袋）適量，精密加入另配的對(duì)照品混合溶液1mL（熊果酸質(zhì)量濃度為5.13 mg/mL，齊墩果酸質(zhì)量濃度為2.60 mg/mL），即得供試品溶液，測定，結(jié)果見表1?？梢娖淦骄厥章史謩e為100.6%和100.4%，RSD分別為1.5%和0.7%，符合分析要求。

表1 齊墩果酸和熊果酸回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.2 樣品中二羥基澤蘭素和腺苷的測定［10-13］

2.2.1 對(duì)照品混合溶液的制備 分別精密稱取二羥基澤蘭素和腺苷對(duì)照品適量，流動(dòng)相溶解，搖勻，即得對(duì)照品混合溶液（二羥基澤蘭素質(zhì)量濃度為2.1μg/mL，腺苷質(zhì)量濃度為20.2μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品10 g，加水20 mL溶解，60℃下超聲提取30 min，乙酸乙酯萃取2次，每次10mL，合并乙酸乙酯液，濃縮蒸至0.5 mL，流動(dòng)相溶解，定容至10 mL，搖勻，微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按風(fēng)梅顆粒處方和工藝，制備不含廣東土牛膝的陰性樣品和供試品溶液。

2.2.4 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫 （0～20 min，22%A；20～30 min，22%A→65%A；30～60 min，65%A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為0～20 min時(shí)260 nm，20～60min時(shí)240 nm。在此條件下，二羥基澤蘭素和腺苷與其他組分離效果良好，且陰性樣品無干擾。另外，以二羥基澤蘭素和腺苷計(jì)，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于2500，分離結(jié)果見圖2。

圖2 二羥基澤蘭素和腺苷的HPLC

2.2.5 線性范圍考察 精密吸取對(duì)照品混合溶液5、10、 15、20、25、30μL，按 “2.2.4”項(xiàng)下色譜條件測定，以峰面積積分值 （Y）為縱坐標(biāo)，二羥基澤蘭素和腺苷量（X）為橫坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。二羥基澤蘭素為Y=4.581 5X+0.858 3，r=0.999 9，線性范圍1.05×10-2～6.3×10-2μg；腺苷為Y=0.229 9X-0.393 3，r=0.999 5，線性范圍0.101～0.606μg。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取 “2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按 “2.2.4”項(xiàng)下色譜條件，測定二羥基澤蘭素和腺苷的峰面積，兩者RSD分別為0.4%和0.6%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取批號(hào)為20130615的樣品，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別測定二羥基澤蘭素和腺苷的含有量，兩者RSD分別為0.9%和0.7%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取批號(hào)為20130615的樣品，于0、1、2、4、6和8 h測定二羥基澤蘭素和腺苷的峰面積，兩者RSD分別為1.0%和1.0%，表明供試品溶液8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取批號(hào)為20130615的含有量已知的樣品 （二羥基澤蘭素 21.25μg/袋、腺苷225.36μg/袋）適量，精密加入另配的對(duì)照品混合溶液1 mL（二羥基澤蘭素質(zhì)量濃度為10.51μg/mL，腺苷質(zhì)量濃度為113.23μg/mL），即得供試品溶液，測定，結(jié)果見表2?？梢娖淦骄厥章史謩e為100.9%和100.3%，RSD分別為1.1%和0.8%，符合分析要求。

表2 二羥基澤蘭素和腺苷回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.3 樣品測定 取3批樣品按 “2.1”項(xiàng)和 “2.2”項(xiàng)下方法測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果 （x±s，n=3）

3 討論

3.1 枇杷葉和廣東土牛膝為風(fēng)梅顆粒主要成分。枇杷葉歸肺、胃經(jīng)，具有清肺止咳、降逆止嘔等功效，臨床上用于肺熱咳嗽、氣逆喘急、胃熱嘔逆、煩熱口渴［14-15］；廣東土牛膝為菊科澤蘭屬植物，有祛風(fēng)、消腫、清熱、解毒、行瘀等功效，主治白喉、乳蛾、咽喉腫痛、吐血、咯血、血淋、外傷腫痛、跌打瘀痛等癥狀［16-18］。另外，齊墩果酸和熊果酸為枇杷葉主要成分，而二羥基澤蘭素和腺苷為廣東土牛膝主要成分。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)風(fēng)梅顆粒中齊墩果酸、熊果酸、二羥基澤蘭素、腺苷進(jìn)行定量測定方法研究，對(duì)完善本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有十分重要的作用，能有效控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。

3.2 檢測波長的選擇 分別取齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解，制成每1 mL含0.10 mg的溶液，按紫外—可見分光光度法在200～400 nm波長處進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品在215 nm處均有最大吸收，故檢測波長定為215 nm；分別取二羥基澤蘭素和腺苷對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解，前者制成每1 mL含1.5μg的溶液，后者制成每1 mL含8.2μg的溶液，按紫外—可見分光光度法在200～400 nm波長處進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者在240 nm處有最大吸收，后者在260 nm處有最大吸收，故檢測波長分別定為240 nm和260 nm。

［1］WS-11423（ZD-1423）-2002，風(fēng)梅顆粒［S］.

［2］王 穎，余曉琴，龍 敏，等.HPLC同時(shí)測定枇杷葉糖漿中熊果酸和齊墩果酸含量［J］.中成藥，2009，31（9）：1389-1391.

［3］張昌浩，吳松吉，朱延萍，等.枇杷葉高效液相指紋圖譜研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18（2）：269-271.

［4］杜豐玉，陳 鈞，許月明，等.高效液相色譜法測定枇杷葉中熊果酸和齊墩果酸含量［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（1）：21-23.

［5］吳 芳，喬蓉霞，張國躍，等.HPLC-ELSD法測定枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2008，23（4）：198-199.

［6］鞠建華，周 亮，鄭瑞霞，等.高效液相色譜法測定中藥枇杷葉中熊果酸的含量［J］.中國藥學(xué)雜志，2003，38（9）：19-21.

［7］羅曉清，郭小儀，俞學(xué)煒.RP-HPLC法測定枇杷葉中熊果酸和齊墩果酸的含量［J］.中國野生植物資源，2004，23（5）：50-51.

［8］李開泉，熊知行.超聲波對(duì)枇杷葉中熊果酸醇提效果的考察［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，（2）：251-252.

［9］朱紅林，段國峰.枇杷葉堿提多糖的分離純化及組成分析［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（4）：307-308.

［10］柳立新，張 毅.不同提取方法對(duì)土牛膝總皂苷含量測定的影響［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17（8）：1296-1297.

［11］歐麗蘭，稅丕先，莊元春，等.高效液相色譜法測定川產(chǎn)土牛膝中齊墩果酸的含量［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011，27（6）：806-807.

［12］李瑞明，張俊鵬，任 斌，等.HPLC法測定廣東土牛膝中二羥基澤蘭素的含量［J］.今日藥學(xué)，2011，21（10）：617-619.

［13］盧綺雯，李 堅(jiān)，蕭 鵬，等.HPLC法測定廣東土牛膝中腺苷的含量［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，23（2）：131-133.

［14］李 婷，林文津，徐榕青，等.枇杷葉的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國野生植物資源，2010，29（5）：11-14，20.

［15］沙 娜，梁敬鈺.枇杷葉研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2006，18（1）：6-11.

［16］饒 芳，李榮群，傅華洲，等.土牛膝治療急性咽喉炎的實(shí)驗(yàn)研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18（33）：4073-4074.

［17］梅全喜，吳惠妃.廣東土牛膝的藥用歷史及現(xiàn)代研究概況［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23（11）：1995-1997.

［18］梅全喜，戴衛(wèi)波.廣東土牛膝治療咽喉疾病功效的發(fā)現(xiàn)與藥用歷史［J］.北方藥學(xué)，2009，6（3）：29，54-57.

R927.2

：B

：1001-1528（2015）06-1379-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.052

2014-04-12

伍婉媚（1985—），女，藥師，從事臨床藥學(xué)服務(wù)。E-mail：lunwenwuwanmei@163.com

*通信作者：張 超（1964—），男，副教授，從事藥物化學(xué)和天然藥物化學(xué)研究。E-mail：lunwenzhangchao@163.com