白藜蘆醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3 的凋亡作用

唐銳先， 張 巍， 趙行宇

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林132013)

卵巢癌是婦科癌癥首要死亡原因。臨床的治療方案常為手術(shù)根治、腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)、鉑類與紫杉醇聯(lián)合化療［1］，手術(shù)切除及細(xì)胞減滅術(shù)對(duì)提高晚期患者生存率的作用有限，而化療治療眾所周知的毒副作用，導(dǎo)致年老、體衰及伴有其他嚴(yán)重基礎(chǔ)病的患者不能耐受，從而影響了卵巢癌患者的生活質(zhì)量［2］。因此，研究白藜蘆醇對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探討該凋亡的發(fā)生機(jī)制，為卵巢癌的預(yù)防與臨床治療方面提供新的、低毒、高效的治療藥物和手段提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)［3］。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和設(shè)備 超凈工作臺(tái)(吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心);HF90/HF240 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heal Force 公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton-Dickson 公司)，倒置顯微鏡(Olympus，日本);96 孔培養(yǎng)板(美國(guó)Corning 公司);低溫冰箱(日本)。

1.2 主要試劑 純度為95%白藜蘆醇粉末(天津邁迪瑞康生物醫(yī)藥科技有限公司);SKOV-3 細(xì)胞、Annexin VFITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(吉林醫(yī)藥學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心);細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640 (美國(guó)Gibco 公司);胎牛血清(吉林省血液病研究所);EDTA (德國(guó)Boehringer Mannheim Gmbl 公司)。

1.3 主要試劑的配置

1.3.1 緩沖平衡鹽溶液 (PBS 緩沖液) 稱取8.0 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4溶 于800 mL 雙蒸水中，調(diào)定pH 至7.4 后定容至1 L，高壓滅菌后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 0.25%胰酶消化液 將0.25 g 胰蛋白酶粉溶于100 mL PBS 液中，充分溶解后置于孔徑為0.22 μm 濾器中過濾除菌，分裝后置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 白藜蘆醇調(diào)配液的儲(chǔ)存與稀釋 純度為95%的白藜蘆醇粉末用DMSO (二甲基亞砜)溶解，配成貯備液(300 mL)后，正壓濾過滅菌，-4 ℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)再以細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640 稀釋至所需實(shí)驗(yàn)濃度。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng) 人類卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3)，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，由吉林醫(yī)藥學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為在5%CO2、濕度95%。每2 天更換1 次培養(yǎng)液，每周按1 ∶3 傳代。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分5 組。即:不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照組與不加藥物的細(xì)胞對(duì)照組、不同濃度白藜蘆醇實(shí)驗(yàn)組(20、40、80 μmol/L)。

1.4.3 MTT 比色法檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3 細(xì)胞，消化制成密度為1 ×105個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，按100 μL/孔接種于96 孔培養(yǎng)板。于5%CO2，37 ℃孵育箱中孵育12 h后，實(shí)驗(yàn)組加入白藜蘆醇與完全培養(yǎng)液配制成20、40、80 μmol/L 的不同濃度藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h，期間在倒置顯微鏡下密切注意觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并拍照。隨后每孔加入20 μL 0.5% MTT，37 ℃孵育4 h，棄去上清后每孔加150 μL DMSO (二甲基亞砜)，在搖床上低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm 波長(zhǎng)測(cè)得光密度值(OD)［4］，以空白對(duì)照調(diào)零，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SKOV-3 細(xì)胞的增殖抑制率表示。增殖抑制率(%) =［1 -(實(shí)驗(yàn)組OD 值-空白對(duì)照組OD值)/(細(xì)胞對(duì)照組OD 值-空白對(duì)照組OD 值)］×100%。

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×105個(gè)/mL，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每孔1 mL，每組設(shè)3 個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)組加入20、40、80 μmol/L 濃度白藜蘆醇，培養(yǎng)24 h 后，70%乙醇4 ℃固定過夜，加入PBS 100 μL，PBS 洗滌細(xì)胞2 次，在15 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液;按試劑盒說明書每孔分別加入Annexin Ⅴ-FITC 和PI 溶液100 μL，避光染色30 min，再加PBS 200 μL 將細(xì)胞懸起，用流式細(xì)胞儀在激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm 處檢測(cè)紅色熒光。結(jié)果使用計(jì)算軟件來(lái)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期各時(shí)期細(xì)胞百分比。

1.4.5 Western blot 檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)把上述實(shí)驗(yàn)組及細(xì)胞對(duì)照組培養(yǎng)的細(xì)胞用裂解液裂解后，收集并提取細(xì)胞蛋白，使用BCA 法測(cè)定各組蛋白的量。上樣量取60 μg 蛋白，設(shè)備為SDS-PAGE 電泳儀，電轉(zhuǎn)凝膠上的蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，兔抗人Caspase-3、Bcl-2 及Bax 抗體稀釋至1 ∶1000，4 ℃冰箱中孵育過夜，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h 后曝光顯影。以β-actin 為內(nèi)參，數(shù)據(jù)以細(xì)胞對(duì)照組為基準(zhǔn)，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組樣品相對(duì)于細(xì)胞對(duì)照組樣品蛋白含有量的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，結(jié)果以±s 表示，F(xiàn) 檢驗(yàn)方差齊性后，t 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，取P ＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.01 為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 白藜蘆醇作用SKOV-3 細(xì)胞24 h 后的倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(見圖1)。結(jié)果顯示:未加白藜蘆醇，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形;加白藜蘆醇后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。隨劑量增加，變化越明顯。

2.2 白藜蘆醇處理SKOV-3 細(xì)胞24 h 后增殖的影響 表1是細(xì)胞對(duì)照組和不同濃度白藜蘆醇復(fù)合培養(yǎng)液實(shí)驗(yàn)組作用24 h 后測(cè)得的OD 值。各組作用于SKOV-3 細(xì)胞后的OD 值與細(xì)胞對(duì)照組OD 值相比下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。濃度較高的OD 值低于濃度較低的OD 值(P ＜0.05)。表2 是各白藜蘆醇觀察組對(duì)SKOV-3 細(xì)胞的增殖抑制率。組間比較各相鄰濃度組的增殖抑制率可見，在同一作用時(shí)間下，濃度較高組的增殖抑制率高于濃度較低組的增殖抑制率(P ＜0.01)。

2.3 流式檢測(cè)結(jié)果 表3 是不同濃度的白藜蘆醇在24 h對(duì)SKOV-3 細(xì)胞的平均凋亡率，表明分別以20、40、80 μmol/L 濃度的白藜蘆醇復(fù)合培養(yǎng)液處理卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞24 h 后，隨藥物劑量的增加，各組細(xì)胞的凋亡率均顯著增高;而且G0/G1期細(xì)胞所占百分率降低，S 期細(xì)胞所占百分比上升，提示白藜蘆醇可以將卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞周期阻滯于S 期，見表3。

圖1 不同濃度的白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞形態(tài)的影響

表1 白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞的光密度值(OD)的影響(n=3)

表2 白藜蘆醇作用SKOV-3 細(xì)胞24 h 后的增殖抑制率(n=3)

表3 不同濃度的白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞的平均凋亡率及細(xì)胞周期的影響

2.4 白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞Caspase-3 及Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá) 與細(xì)胞對(duì)照組比較，使用白藜蘆醇復(fù)合培養(yǎng)液后，Caspase-3 蛋白表達(dá)增加，Bcl-2 蛋白表達(dá)下降;Bax 蛋白表達(dá)增加(P ＜0.01)。隨劑量增加，變化越明顯，具有劑量依賴特性，見表4。

表4 各組Caspase-3 及Bcl-2 和Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量(±s)

表4 各組Caspase-3 及Bcl-2 和Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量(±s)

注:與細(xì)胞對(duì)照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 Caspase-3 Bcl-2 Bax細(xì)胞對(duì)照組 0.83 ±0.17 1.13 ±0.15 0.78 ±0.39 20 μmol/L 白黎蘆醇組 1.31 ±0.67 0.92 ±0.17 1.34 ±0.49 40 μmol/L 白黎蘆醇組 1.84 ±0.83* 0.73 ±0.18 1.81 ±0.35 80 μmol/L 白黎蘆醇組 2.03 ±0.92＊＊ 0.52 ±0.17* 2.45 ±0.57

圖2 不同濃度白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

白藜蘆醇 (resveratrol，Res)，是一種天然多酚類物質(zhì)，在花生、葡萄、虎杖等植物中廣泛存在。近年來(lái)有研究表明，白藜蘆醇為一生物還原劑，對(duì)炎性反應(yīng)及應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子有良好的清除作用，常作為抗衰老、抗代謝綜合征的化學(xué)預(yù)防劑［5］。此外白藜蘆醇對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有良好的細(xì)胞毒作用［6-7］。它對(duì)抗腫瘤的藥用機(jī)制及可能的分子生物學(xué)通路已成為研究熱點(diǎn)。

MTT 比色法因其快速、簡(jiǎn)便、靈活等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于生物因子的活性檢測(cè)、腫瘤放射敏感性測(cè)定、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、抗癌藥物對(duì)腫瘤增殖活性的影響等方面［8］。本研究通過MTT 法測(cè)定不同濃度處理過的人卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞光密度值(OD 值)，來(lái)計(jì)算白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞的增殖抑制率。從研究的結(jié)果來(lái)看，在同一作用時(shí)間下，白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞的增殖抑制率隨其濃度的升高呈逐漸上升趨勢(shì)。提示白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞的增殖抑制作用呈濃度依賴性。倒置纖維鏡觀察到SKOV-3 細(xì)胞密度明顯減少，間隙增寬，偽足回縮，細(xì)胞變圓、懸浮，胞質(zhì)減少，折光性差，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制明顯。這與其他相類似研究結(jié)果相同［9-10］。

本研究利用流式細(xì)胞儀觀察了白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞周期的影響。流式檢測(cè)中使用的試劑盒中Annexin V 是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一［11］，碘化丙啶(PI)對(duì)凋亡中晚期細(xì)胞膜通透性增加的細(xì)胞和死細(xì)胞具有良好的染色作用。Annexin V 與PI 匹配使用有利于更加準(zhǔn)確地觀測(cè)白藜蘆醇對(duì)人卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的影響［12］。檢測(cè)結(jié)果表明，SKOV-3 細(xì)胞在不同濃度白藜蘆醇復(fù)合培養(yǎng)液處理后，凋亡率隨著濃度的增加而升高，SKOV-3 細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞百分比隨藥物濃度增高而逐漸降低，S 期細(xì)胞百分比逐漸增加，表明白藜蘆醇抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力體現(xiàn)在將卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞周期阻滯于S 期［13］。

為進(jìn)一步觀察上述作用的相關(guān)因素，本研究還采用Western blot 法檢測(cè)不同濃度白藜蘆醇復(fù)合培養(yǎng)液對(duì)人卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞株處理后細(xì)胞凋亡控制蛋白Caspase-3、Bcl-2 與Bax 蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明白藜蘆醇作用于細(xì)胞后，隨著其濃度的增加，Bcl-2 的表達(dá)減少，而Bax、Caspase-3表達(dá)則增加，Bcl-2/Bax 比值與細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)一定的負(fù)相關(guān)性，表明白藜蘆醇誘導(dǎo)SKOV-3 細(xì)胞凋亡與抑制抗凋亡因子Bcl-2 的表達(dá)并且激活凋亡因子Bax 的表達(dá)、激活Caspase 凋亡通路有關(guān)［14］。

綜上所述，白藜蘆醇可抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV-3 的生長(zhǎng)，阻斷在細(xì)胞周期S 期的增殖;其機(jī)制與增強(qiáng)凋亡因子Bax 的表達(dá)同時(shí)抑制抗凋亡因子Bcl-2 的表達(dá)相關(guān)聯(lián)，并且這樣的作用與細(xì)胞分裂阻滯及激活Caspase 凋亡通路有關(guān)［15-16］。但其誘導(dǎo)卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞凋亡的過程中其他相關(guān)蛋白表達(dá)及變化規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。

［1］ 汪維佳，虞 娉. 白藜蘆醇增強(qiáng)順鉑對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402的生長(zhǎng)抑制作用［J］. 實(shí)用腫瘤雜志，2009，24(2):157-159.

［2］ 張?chǎng)┍? 卵巢癌化療耐藥相關(guān)基因與預(yù)后的研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué):婦產(chǎn)科學(xué)分冊(cè)，2007，3(34):193-196.

［3］ Huang X，Zhu H L. Resveratrol and its analogues:promising antitumor agents［J］. Anticancer Agents Med Chem，2011，11(5):479-490.

［4］ 藍(lán)鴻雁，張紀(jì)妍，陳 杰，等. 白藜蘆醇誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制［J］. 山東醫(yī)藥，2014，54(1):32-33，39.

［5］ 唐夢(mèng)君. 白藜蘆醇對(duì)肝癌Bel-7404 細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲影響機(jī)制研究［J］. 海峽藥學(xué)，2013，25(2):241-243.

［6］ 黃明明，蔡衛(wèi)東，劉永輝. 白藜蘆醇對(duì)胃癌細(xì)胞Ras 相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族1A 基因甲基化及表達(dá)的影響［J］. 當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2011，17(18):21-22.

［7］ 韓志遠(yuǎn)，張 慧，楊巧媛. 白藜蘆醇抑制H460 肺癌細(xì)胞的增殖作用研究［J］. 中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2014，14(1):214-215.

［8］ 李上標(biāo)，裴淑艷，蔣 超，等. MTT 比色法研究應(yīng)用進(jìn)展［J］. 西北民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，34(3):68-73.

［9］ 李 攀，陸曉媛. 白藜蘆醇對(duì)人卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞增殖的影響［J］. 徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，32(2):124-126.

［10］ 郭莉媛，彭 艷，李玉蓮，等. 白藜蘆醇白蛋白納米粒致卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞死亡的機(jī)制［J］. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30(11):2440-2442.

［11］ 張 偉，梁智輝. Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)記與Hoechst33342 /PI 雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的比較［J］. 細(xì) 胞 與 分 子 免 疫 學(xué) 雜 志，2014，30 (11):1209-1212.

［12］ Bernier S M，Yamada Y. Modulation of annexin V during chondrocytic differentiationin vitro［J］. Ann N Y Acad Sci，1996，785:212-214.

［13］ Piotrowska H，Myszkowski K，Zió?kowska A，et al. Resveratrol analogue3，4，4＇，5-tetramethoxy Stilbeneinhibi its growth，arrests cell cycle and induces apoptosisin ovarian，Skov-3 and A-2780 cancer cells［J］. Toxicol Appl Pharmacol，2012，263(1):53-60

［14］ 于慧玲，李冬梅，屠 軍，等. 宮頸鱗癌患者血液、癌組織中Survivin、Caspase-3、Bcl-2 和Bax 的表達(dá)及其相互關(guān)系［J］. 中國(guó)婦科幼保健，2014，26(9):22-24

［15］ Yu H B，Zhang H F，Zhang X，et al. Resveratrol inhibits VEGF expression of human hepatocellular carcinoma cells through a NF-kappa B mediated mechanism［J］. Hepatogastroenterology，2010，57(102-103):1241-1246.

［16］ 程海燕，周家華，楊德同. 白藜蘆醇誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡通路的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2010，38(5):515-517.