松脂皺皮孔菌發(fā)酵液化學(xué)成分的研究

吳培云， 陸云德，， 劉吉開(kāi)， 王 剛*

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230012;2. 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，云南昆明650201)

松脂皺皮孔菌Ischnoderma resinosum 屬于多孔菌科皺皮菌屬高等真菌，子實(shí)體大，主要分布在黑龍江、吉林、河北、廣西、云南、陜西、四川、西藏等地。另外，該菌亦可食用，能引起針葉或闊葉樹(shù)木材白色腐朽，而且朽材松軟，常出現(xiàn)白色絹絲狀斑紋。文獻(xiàn)［1］報(bào)道，松脂皺皮孔菌具有抗癌活性，對(duì)肉瘤S-180 的抑制率為70%，而對(duì)艾氏癌的抑制率為80%。

高等真菌屬于“創(chuàng)造系數(shù)”很高的生物資源［2］，含有大量結(jié)構(gòu)新穎和生物活性顯著的次生代謝產(chǎn)物，目前人們已從中發(fā)現(xiàn)了許多生物活性很高的先導(dǎo)母體化合物，其中有不少種類易于發(fā)酵培養(yǎng)。其應(yīng)用于代謝產(chǎn)物生產(chǎn)時(shí)具有很多優(yōu)點(diǎn)，能克服化學(xué)合成中可能存在的不經(jīng)濟(jì)性，而且發(fā)酵培養(yǎng)具有可通過(guò)篩選來(lái)獲得高產(chǎn)菌種、容易控制培養(yǎng)條件、產(chǎn)物質(zhì)量可靠、易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)［3］。目前，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)松脂皺皮孔菌化學(xué)成分的研究報(bào)道，為了從該真菌中尋找活性成分，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，結(jié)果從中分離出了10 個(gè)化合物，分別鑒定為rosenonolactone(1)、2-nonyne-1，4-diol (2)、1-hydroxy-2-nonyn-4-one (3)、過(guò)氧麥角甾醇(4)、麥角甾-4，6，8(14)，22-四烯-3-酮(5)、麥角甾-5，7，22-三烯-3β-醇(6)、麥角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇(7)、anti-1-(4-methoxyphenyl)proane-1，2-diol(8)、syn-1- (4-methoxyphenyl) proane-1，2-diol(9)、1-phenylpropane-1，2-diol (10)。而且，所有化合物均為首次從松脂皺皮孔菌中分離得到。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料及儀器 Bruker AV-400、AVANCE Ⅲ-500、600 核磁共振儀，內(nèi)標(biāo)為T(mén)MS (德國(guó)Bruker公司);VG AutoSpec-3000 質(zhì)譜儀 (英國(guó)VG 公司);薄層層析、柱層析硅膠(青島海洋化工有限公司);Agilent 1100 HPLC 色譜儀、Agilent Zorbax SB-C18色譜柱 (美國(guó)Agilent Technologies 公司);YMC 色譜柱(日本YMC 公司);Lichroprep Rp-18反相硅膠(40 ～63 μm，德國(guó)Merck 公司);Sephadex LH-20 凝膠 (瑞典Amersham Biosciences 公司)。乙腈、甲醇均為色譜純(天津市大茂化學(xué)試劑廠);氯仿、甲醇、石油醚、乙酸乙酯均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

松脂皺皮孔菌于2006 年8 月采自吉林長(zhǎng)白山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，由北京林業(yè)大學(xué)戴玉成教授鑒定為多孔菌科皺皮菌屬高等真菌松脂皺皮孔菌Ischnoderma resinosum，標(biāo)本保存于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所標(biāo)本館。

1.2 發(fā)酵與培養(yǎng) 根據(jù)昆明植物研究所李正輝工程師采用的斜面轉(zhuǎn)搖瓶液體培養(yǎng)方法［4］，對(duì)該菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。其中，培養(yǎng)基為5% 葡萄糖，0.1%豬肉蛋白胨，0.5%酵母粉，0.05% KH2PO4和MgSO4，25 ℃下?lián)u床發(fā)酵25 d，轉(zhuǎn)速為160 ～165 r/min，裝液量350 mL，發(fā)酵液總量20 L。

1.3 提取分離 取松脂皺皮孔菌Ischnoderma resinosum 發(fā)酵液20 L，乙酸乙酯萃取3 次后合并，減壓濃縮，得到18 g 粗提物。然后，經(jīng)硅膠柱色譜，三氯甲烷-甲醇(100 ∶0→0 ∶100)梯度洗脫，得到7 個(gè)組分(A、B、C、D、E、F、G)。

組分C (三氯甲烷∶甲醇=100 ∶2)經(jīng)中壓反相RP-18 柱色譜，甲醇-水(30 ∶70→100 ∶0)梯度洗脫，得到13 個(gè)亞組分(C1～C13)。其中，C3經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(5 ∶1)洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，三氯甲烷-甲醇(1 ∶1)洗脫，得到化合物10 (3.9 mg);C4經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(12 ∶1→5 ∶1)梯度洗脫，再經(jīng)反相HPLC 制備柱色譜，乙腈-水(0 ∶100 →30 ∶70)梯度洗脫，得到化合物8(110.5 mg)和9 (52.3 mg);C8經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，三氯甲烷-甲醇(1 ∶1)洗脫，再經(jīng)反相RP-18 柱色譜，甲醇-水(30 ∶70→40 ∶60)梯度洗脫，得到化合物2 (23.4 mg);C9經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，三氯甲烷∶甲醇(1 ∶1)洗脫，再經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(8 ∶1)洗脫，得到化合物3 (2.1 mg);C10經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，三氯甲烷-甲醇(1 ∶1)洗脫，再經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(15 ∶1)洗脫，得到化合物1 (13.1 mg);C11經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(10 ∶1)洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，三氯甲烷-甲醇(1 ∶1)洗脫，得到化合物5(7.2 mg);C12經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，三氯甲烷-甲醇(1 ∶1)洗脫，再經(jīng)重結(jié)晶后得到化合物4 (3.8 mg)和6 (2.6 mg);C13經(jīng)重結(jié)晶后，得到化合物7 (3.3 mg)。

2 結(jié)果與討論

化合物1:白色針晶，ESI-MS m/z 339 ［M +Na］+。1H-NMR (CDCl3，400 MHz)δ:5.81 (1H，dd，J =17.5，10.7 Hz，H-15)，4.98 (1H，d，J =17.5 Hz，H-16)，4.91 (1H，d，J =10.7 Hz，H-16)，2.41 (1H，m，H-8)，2.40 (1H，m，H-6β)，2.27 (1H，m，H-1)，2.26 (1H，m，H-5)，2.13(1H，m，H-6α)，1.96 (1H，m，H-2β)，1.93(1H，m，H-11β)，1.77 (1H，m，H-3β)，1.76(1H，m，H-2α)，1.67 (1H，m，H-11α)，1.59(1H，m，H-3α)，1.51 (2H，m，H-12)，1.32 (1H，m，H-14)，1.12 (3H，s，H-18)，0.96 (3H，s，H-17)，0.94 (3H，s，H-20)。13C-NMR (CDCl3，100 MHz)δ:210.3 (C-7)，179.3 (C-19)，149.5 (C-15)，109.9 (C-16)，86.9 (C-10)，50.9 (C-5)，47.3 (C-8)，47.2 (C-4)，38.8 (C-9)，35.8 (C-6)，35.4 (C-3)，35.0 (C-13)，31.6 (C-14)，31.4(C-12)，30.7 (C-11)，30.2 (C-1)，21.8 (C-17)，19.8 (C-2)，16.9 (C-18)，16.8 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5］ 報(bào)道基本一致，確定該化合物為rosenonolactone。

化合物2:無(wú)色油狀物，ESI-MS m/z 179 ［M+Na］+。1H-NMR (CDCl3，500 MHz)δ:4.38 (1H，t，J =6.5 Hz，H-4)，4.28 (2H，brs，H-1)，1.66(2H，m，H-5)，1.42 (2H，m，H-6)，1.29 (4H，m，H-7，8)，0.88 (3H，t ，J =6.9 Hz，H-9)。13CNMR (CDCl3，125 MHz)δ:86.7 (C-3)，82.9 (C-2)，62.2 (C-4)，50.6 (C-1)，37.5 (C-5)，31.4(C-7)，24.9 (C-6)，22.5 (C-8)，14.0 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報(bào)道基本一致，確定該化合物為2-nonyne-1，4-diol。

化合物3:無(wú)色油狀物，ESI-MS m/z 177 ［M+Na］+。1H-NMR (CDCl3，600 MHz)δ:4.44 (2H，brs，H-1)，2.56 (2H，t，J =7.2 Hz，H-5)，1.67(2H，m，H-6)，1.31 (2H，m，H-8)，1.29 (2H，m，H-7)，0.89 (3H，t，J =7.2 Hz，H-9)。13CNMR (CDCl3，150 MHz)δ:180.0 (C-4)，89.4 (C-3)，84.8 (C-3)，51.1 (C-1)，45.5 (C-5)，31.3(C-7)，23.7 (C-6)，22.5 (C-8)，14.1 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報(bào)道基本一致，確定該化合物為1-hydroxy-2-nonyn-4-one。

化合物4:無(wú)色針晶。其TLC 的Rf值及顯色行為均與過(guò)氧麥角甾醇對(duì)照品一致，而且與對(duì)照品混合時(shí)熔點(diǎn)不下降，確定該化合物為過(guò)氧麥角甾醇。

化合物 5:無(wú)色針晶，EI-MS m/z 392［M］+。1H-NMR (CDCl3，400 MHz)δ:6.56 (1H，d，J=9.4 Hz，H-7)，6.02 (1H，d，J=9.4 Hz，H-6)，5.71 (1H，s，H-4)，5.24 (1H，dd，J =15.2，7.2 Hz，H-23)，5.18 (1H，dd，J =15.2，7.2 Hz，H-22)，1.03 (3H，d，J = 6.6 Hz，H-21)，0.97(3H，s，H-19)，0.93 (3H，s，H-18)，0.90 (3H，d，J =6.8 Hz，H-28)，0.82 (3H，d，J =6.8 Hz，H-27)，0.77 (3H，d，J=6.6 Hz，H -26)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道基本一致，確定該化合物為麥角甾-4，6，8 (14)，22-四烯-3-酮。

化合物 6:無(wú)色針晶，EI-MS m/z 396［M］+。1H-NMR (CDCl3，400 MHz)δ:5.57 (1H，m，H-6)，5.38 (1H，m，H-7)，5.22 (1H，m，H-23)，5.16 (1H，m，H-22)，3.62 (1H，m，H-3)，1.04 (3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.97 (3H，s，H-19)，0.92 (3H，d，J=6.6 Hz，H-28)，0.84 (3H，d，J =6.6 Hz，H-27)，0.82 (3H，d，J =6.6 Hz，H-26)，0.63 (3H，s，H-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道基本一致，確定該化合物為麥角甾-5，7，22-三烯-3β-醇。

化合物 7:無(wú)色針晶，EI-MS m/z 430［M］+。1H-NMR (C5D5N，400 MHz)δ:5.74 (1H，m，H-7)，5.24 (1H，m，H-23)，5.16 (1H，m，H-22)，4.82 (1H，m，H-13)，4.30 (1H，brs，J=4.8 Hz，H-6)，1.52 (3H，s，H-19)，1.06 (3H，d，J=6.4 Hz，H-21)，0.93 (3H，d，J =6.8 Hz，H-28)，0.83 (3H，d，J =6.7 Hz，H-27)，0.83 (3H，d，J=6.7 Hz，H-26)，0.66 (3H，s，H-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］ 報(bào)道基本一致，確定該化合物為麥角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇。

化合物 8:無(wú)色針晶，EI-MS m/z 182［M］+。1H-NMR (CD3OD，400MHz)δ:7.27 (2H，dd，J =8.7，2.6 Hz，H-2＇，6＇)，6.87 (2H，dd，J =8.7，2.6 Hz，H-3＇，5＇)，4.43 (1H，d，J =5.2 Hz，H-1)，3.83 (1H，m，H-2)，3.76 (3H，s，-OCH3)，1.11 (3H，d，J = 6.3 Hz，H-3)。13CNMR (CD3OD，100 MHz)δ:160.4 (C-4＇)，135.3(C-1＇)，129.2 (C-2＇，6＇)，114.4 (C-3＇，5＇)，78.7(C-1)，72.4 (C-2)，55.7 (-OCH3)，18.4 (C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］ 報(bào)道基本一致，確定該化合物為anti-1-(4-methoxyphenyl)proane-1，2-diol。

化合物 9:無(wú)色針晶，EI-MS m/z 182［M］+。1H-NMR (CD3OD，400 MHz)δ:7.25 (2H，dd，J =8.6，2.6 Hz，H-2＇，6＇)，6.88 (2H，dd，J=8.6，2.6Hz，H-3＇，5＇)，4.28 (1H，d，J =7.3 Hz，H-1)，3.78 (1H，m，H-2)，3.75 (3H，s，-OCH3)，0.93 (3H，d，J=6.4 Hz，H-3)。13C-NMR(CD3OD，100 MHz)δ:160.7 (C-4＇)，135.3 (C-1＇)，129.4 (C-2＇，6＇)，114.6 (C-3＇，5＇)，79.9(C-1)，73.0 (C-2)，55.7 (-OCH3)，19.3 (C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］ 報(bào)道基本一致，確定該化合物為syn-1- (4-methoxyphenyl)proane-1，2-diol。

化合物10:無(wú)色針晶。其TLC 的Rf值及顯色行為均與1-phenylpropane-1，2-diol 對(duì)照品一致，而且兩者混合時(shí)熔點(diǎn)不下降，確定該化合物為1-phenylpropane-1，2-diol。

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