HPLC 法同時(shí)測定黃山貢菊和七月菊中的4 種化學(xué)成分

姜文青， 張亞中，* ， 金 斌

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230038;2. 安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥230051)

菊花是菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat 的干燥頭狀花序，主治風(fēng)熱感冒、溫病初起、肝陽眩暈、實(shí)肝風(fēng)證、目赤昏花、瘡癰腫毒等癥狀，而且療效理想?，F(xiàn)代研究表明，菊花含有黃酮類、酚酸類以及揮發(fā)性成分等活性物質(zhì)，有著多種生理功能［1-5］。其中，黃山貢菊Dendranthema morifolium (Ramat)Tzvel. cv. Gongju 生長于海拔較高的山地，受當(dāng)?shù)鬲?dú)特氣候及良好環(huán)境的影響，其外觀、形態(tài)和品質(zhì)均與生長于平原的菊花有所區(qū)別，而七月菊Dendranthema morifolium (Ramat)Tzvel. cv. Qiyueju 又稱“早貢菊”，是黃山貢菊的人工培植品。近年來，關(guān)于黃山貢菊的研究多集中在化學(xué)成分分析、含有量測定以及指紋圖譜考察上，但鮮有對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的報(bào)道［6-9］。本實(shí)驗(yàn)首次建立了同時(shí)測定黃山貢菊和七月菊中綠原酸、木犀草素、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩徇@四種活性成分含有量的方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)。

1 儀器、試劑與藥品

LC-20AD HPLC 色譜儀 (日本島津公司);AG135 電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo 公司);Agilent 8453 紫外可見分光光度計(jì)(美國Agilent 公司);KQ2200DB 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

綠原酸 (批號(hào)110753-200413)、木犀草苷(批號(hào)111720-200604)、木犀草素(批號(hào)111520-200504)、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?批號(hào)111782-201204)對照品(中國藥品生物制品檢定所)。甲酸和乙腈均為色譜純(美國Waters 公司)。

所有樣品均采自安徽省黃山市歙縣，其中七月菊(QYJ1 ～QYJ12)均來自陳村鎮(zhèn);黃山貢菊(GJ13 ～GJ33)來自大谷運(yùn)村、金竹嶺村及西坡村，均由安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院張亞中博士鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［10-12］Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫，順序見表1;體積流量1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長348 nm;進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在上述條件下，各組分得到良好分離，與相鄰組分峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)不低于3 000，見圖1。

表1 梯度洗脫順序Tab.1 Sequence of gradient elution

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸8.19 mg、木犀草苷7.76 mg、木犀草素7.93 mg、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?.67 mg，置于10 mL 棕色量瓶中，70%甲醇溶解后定容，搖勻，即得。

圖1 三種樣品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of three samples

2.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取黃山貢菊和七月菊粉末(過2 號(hào)篩)約0.25 g，置于50 mL圓底燒瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，加熱回流提取30 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取一定體積的對照品溶液，置于50 mL 量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品貯備液。然后，分別精密吸取1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。接著，分別精密吸取10 uL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分析測定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo) (Y)，對照品溶液的質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)(X)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，結(jié)果見表2。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積RSD。結(jié)果，綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩帷⒛鞠菟氐腞SD 值分別為0.4%、0.4%、0.5%、0.8%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取菊花粉末6 份，每份約0.25 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL 分析測定，記錄峰面積RSD。結(jié)果，綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素的 RSD 值分別為0.9%、0.3%、0.3%、1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定，記錄峰面積RSD。結(jié)果，綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素的RSD 值分別為0.6%、1.5%、0.2%、0.7%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 4 種化學(xué)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab.2 Regression equations，correlation coefficients and linearity ranges of four chemical constituents

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)菊花(GJ-20)6 份，每份約0.125 g，再分別精密加入綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素的對照品貯備液0.54、0.68、1.36、0.01 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素的平均回收率 (n = 6)分別為99.0%、98.1%、100.1%、100.2%，RSD 分別為2.2%、1.3%、1.9%、1.5%，表明該方法回收率良好，見表3。

2.9 樣品測定 按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，計(jì)算各樣品中4 種成分的含有量、平均值以及RSD值，見表4，其含有量的趨勢見圖2 和圖3。結(jié)果顯示，黃山貢菊中木犀草苷的含有量明顯高于七月菊，但木犀草素的含有量低于后者。

表3 4 種化學(xué)成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Result of recovey tests of four chemical constituents

表4 4 種化學(xué)成分含有量的分析結(jié)果Tab.4 Analysis result of the contents of four chemical constituents

圖2 綠原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷辛康内厔輬DFig.2 Content trendgram of chlorogenic acid，galuteolin and 3，5-dicaffeoyl quinic acid

圖3 木犀草素含有量的趨勢圖Fig.3 Content trendgram of luteolin

3 討論

近年來，人們?yōu)榱擞鲜袌鲂枨蠖罅糠N植七月菊，并利用其產(chǎn)量大、價(jià)格低的優(yōu)勢逐漸占據(jù)市場，形成了與黃山貢菊“平分天下”的趨勢。然而，由于黃山貢菊缺少專有的質(zhì)量評價(jià)體系，使其與七月菊難以區(qū)分，嚴(yán)重阻礙影響了這一優(yōu)質(zhì)道地植物的發(fā)展持續(xù)性和質(zhì)量穩(wěn)定性［13］。

本實(shí)驗(yàn)通過HPLC 法，對21 批黃山貢菊和12批七月菊中綠原酸、木犀草素、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮辛窟M(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)《中國藥典》2010 年版中的方法無法將黃山貢菊色譜圖上這4 種成分的色譜峰完全分離。因此，通過調(diào)整樣品的提取方法、流動(dòng)相和梯度洗脫順序，使得各色譜峰的分離度提高，其中七月菊中木犀草苷的含有量為0.31 ～1.21 mg/g，顯著低于黃山貢菊中的2.26 ～8.12 mg/g，但前者中木犀草素的含有量為0.03 ～0.73 mg/g，整體上高于后者中的0.07～0.28 mg/g。由此，根據(jù)這兩種成分含有量的不同，可尋找出兩種屬菊花之間的差異，為黃山貢菊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)。

同時(shí)，木犀草苷具有較強(qiáng)的呼吸道殺菌、增強(qiáng)毛細(xì)血管舒張、解熱抗炎、抗腫瘤等作用，而木犀草素有著清熱解毒、祛痰、鎮(zhèn)咳、抗炎、抗過敏和增強(qiáng)免疫等活性［14-15］，故兩者均可作為控制兩種屬菊花質(zhì)量的指標(biāo)性成分，為全面客觀地評價(jià)其品質(zhì)及臨床應(yīng)用提供了參考。

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