HPLC-ELSD 法測定生脈飲中麥冬皂苷D

繆菊連， 黃照昌， 王成軍， 楊永壽

(1. 大理學院藥學與化學學院，云南 大理671000;2. 大理藥業(yè)，云南 大理671000)

生脈飲原名“生脈散”，出自金元時代名醫(yī)李東垣所著的《內外傷辨惑論》，由紅參100 g、麥冬200 g、五味子100 g 組成，為《中國藥典》2010 年版一部“成方制劑和單味制劑”項下收載品種［1］，有益氣生津、斂陰止汗之功效［2］，用于治療氣陰兩虛、心悸氣短、脈微自汗，氣血兩虛型脫發(fā)、失眠等癥［3-4］?！吨袊幍洹?010 年版項下對生脈飲質量控制標準是采用人參二醇、人參三醇和麥冬對照藥材為對照，對紅參、麥冬進行了TLC 鑒別，無成分定量測定項。2011 年10 月國家藥品標準頒布的批件號為ZGB201-20 生脈飲藥品標準中，只在《中國藥典》2010 年版的基礎上增加五味子藥材TLC 鑒別和五味子醇甲定量測定項目。從文獻資料報道來看，主要增加了五味子乙素、五味子醇甲和人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的HPLC 測定［5-10］。麥冬皂苷［11］具有抗心肌缺血、抗心肌梗阻、抗心律失常的作用，影響心肌的生理特性，而在麥冬皂苷中又以麥冬皂苷D 為主。如能對生脈飲中的麥冬皂苷進行測定，將有助于更全面的評價產品的質量。本實驗建立HPLC-ELSD 測定麥冬皂苷D 的方法，對全面評價生脈飲的質量提供一定的依據。

1 儀器與試劑

1260 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司);2000ES ELSD 檢測器(美國奧泰公司);色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5.0 μm)，BP2250 電 子 天 平 (Sartorius 公 司)，Cleanert ODS C18小柱(天津博納艾杰爾科技有限公司);麥冬皂苷D 對照品(上海源葉生物科技有限公司提供，批號SM0521KA13，純度98.2%);乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，純化水(自制);生脈飲自制(批號分別為130501，130502，130503)。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取麥冬皂苷D 對照品2.02 mg 置于5 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻即得，質量濃度為404 μg/mL。

2.2 供試品溶液的制備 取紅參100 g，麥冬200 g，五味子100 g 粗粉，用65%乙醇浸漬24 h 后滲漉，收集滲漉液4 500 mL，減壓濃縮至250 mL，放冷，加水400 mL 稀釋，濾過，另加60%糖漿300 mL，用10%氫氧化鈉溶液調節(jié)pH 值至6.5，加水至1 000 mL，精密量取20 mL 置于分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取4 次，每次30 mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘渣加2 mL 水溶解，上處理好的ODS小柱，控制上樣和洗脫過程體積流量為0.7 mL/min，先用20 mL 水沖洗，再用55%甲醇水溶液20 mL 沖洗，最后用65%甲醇水溶液30 mL 沖洗，收集65%甲醇水溶液，水浴蒸干，殘渣用甲醇轉移至2 mL 量瓶中，定容至刻度，搖勻即得。

2.3 陰性樣品溶液的制備 按“2.2”項制備方法制得不含麥冬的陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件 UItimate XB-C18色譜柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)，體積流量2.5 mL/min，進樣量20 μL，ELSD檢測器，氣體體積流量2.5 L/min，漂移管溫度95 ℃;流動相為乙腈-水(52 ∶48)，進樣量為20 μL，結果見圖1、2、3。

圖1 麥冬皂苷D 對照品HPLC 圖

圖2 供試品

圖3 陰性供試品

2.5 標準曲線與線性范圍 配制對照品系列溶液，使麥冬皂苷D 質量濃度分別為5、10、20、40、80 μg/mL，依次進樣20 μL，按上述色譜條件依法測量它們的峰面積，以質量濃度的對數(logC)為橫坐標X，以峰面積的對數(logA)為縱坐標Y，進行線性回歸，得線性方程為:Y =1.024 9X+0.996 8，r=0.999 7，線性范圍5 ～80 μg/mL。

2.6 精密度試驗 取質量濃度為10 μg/mL 的對照品溶液6 份，分別精密吸取20 μL 注入液相色譜儀進行測定，計算，結 果 分 別 為10.05、10.22、10.22、10.01、9.82、10.18 μg/mL，平均為10.08 μg/mL，RSD 為1.6%。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取本品(批號130501)按要求制得的供試品溶液分別在0、2、4、8、12、24 h 精密吸取20 μL注入液相色譜儀進行測定，計算，結果為10.05、10.03、9.82、10.15、9.96、10.24 μg/mL，平均為10.04 μg/mL，RSD 為1.5%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗 精密量取同一批次的生脈飲(130501)樣品6 份，在上述色譜條件下分別進行HPLC 分析，計算麥冬皂苷D 的量，RSD 為1.3%。

2.9 加樣回收率試驗 精密吸取對照品溶液(質量濃度為404 μg/mL)40、50、60 μL 各3 份，每份精密加入生脈飲10 mL，置于分液漏斗中，按“2.2”項進行樣品處理，依法測定，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

2.10 樣品測定 精密量取3 個批號(130501、130502、130503)的生脈飲，配制成供試品溶液，在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液10 μL、20 μL 與供試品20 μL，注入液相色譜儀，按外標兩點法計算麥冬皂苷D 的量，結果分別為(10.18 ±0.072)μg/mL、 (10.60 ±0.090)μg/mL、(10.43±0.046)μg/mL。

3 討論

本實驗對樣品的前處理方法進行了研究，比較了直接蒸干用甲醇定容、高速離心、正丁醇-水液液萃取、固相小柱萃取及大孔吸附樹脂除雜5 種方法對樣品中雜質的除去及麥冬皂苷D 的影響，結果表明，各種前處理方法均不能充分去除雜質，對麥冬皂苷D 的測定影響較大。而采用正丁醇-水液液萃取結合固相小柱萃取的方法，在除去雜質的同時能將正丁醇部位所含成分全部洗脫下來。實驗中用中藥材按相同比例制備了紅參-五味子(缺麥冬)的樣品溶液，按本方法分析，結果顯示待測定的組分均不存在明顯干擾，見圖3。Chang［12］等采用HPLC-MS 對生脈散中活性成分進行分析，檢測到生脈散中麥冬活性成分之一麥冬甲基黃烷酮B。王艷慧等［13］采用HPLC-DAD-MS/MS 對不同來源生脈產品質量評價，Zhang 等［14］采用HPLC-MS-MS 對參麥注射液進行分析，麥冬作為產品不可或缺的組成藥味，在產品中并沒有檢出麥冬的成分，可能原因，一是麥冬藥材中麥冬皂苷D 的平均含有量約為0.03%［15］，量很低，加之生產過程的損失，導致產品中含有量不高;二是人參、五味子藥材的存在對麥冬皂苷D 的檢測干擾較大，需進行較為徹底的前處理。

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